17-β-雌二醇對白假絲酵母菌藥物外排泵的影響.pdf

1、背景:
　　近幾年隨著廣泛而重復(fù)的使用，抗真菌藥物的耐藥率逐漸增加。白假絲酵母菌是外陰陰道假絲酵母菌病的主要致病菌，治療上以氟康唑為代表的唑類藥物是首選。藥物外排泵的過度表達是白假絲酵母菌的主要耐藥機制。假絲酵母菌耐藥蛋白是重要的外排泵，包括10種Cdrp，其中Cdrp1與Cdrp2與唑類耐藥相關(guān)。熒光染料羅丹明6G是假絲酵母菌藥物外排泵的底物，檢測酵母菌細胞內(nèi)羅丹明6G的累積量是一種有效的分析Cdrp功能的方法。雌激素可能作為環(huán)

2、境刺激因素對白假絲酵母菌的藥物外排泵產(chǎn)生一定的影響，為此研究17-β-雌二醇對唑類藥物敏感性、唑類外排和耐藥基因表達的影響。
　　研究目的:
　　本研究通過微量稀釋法、流式細胞術(shù)和實時熒光定量PCR評估17-β-雌二醇對唑類藥物敏感性、唑類外排和耐藥基因表達的影響。
　　材料與方法:
　　1.標(biāo)本采集
　　白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌株SC5314和ATCC90028
　　32株臨床菌株分離自北京大學(xué)深圳醫(yī)院婦

3、科門診VVC和RVVC患者陰道分泌物標(biāo)本。
　　2.不同濃度17-β-雌二醇對氟康唑和特康唑藥敏結(jié)果的影響
　　根據(jù)CLSI M27-A3方案，檢測10-10M-10-5M17-β-雌二醇作用下氟康唑和特康唑MIC值的變化。
　　3.流式細胞術(shù)檢測17-β-雌二醇對羅丹明6G外排的影響
　　設(shè)置陰性對照、乙醇對照、10-5M17-β-雌二醇和10-10M17-β-雌二醇試驗組，羅丹明6G加入無糖PBS中達到10μ

4、M濃度，30℃振蕩培養(yǎng)，40min后流式細胞儀定量檢測酵母菌細胞內(nèi)的熒光信號，記錄為羅丹明6G的吸收值。洗滌去除胞外多余的羅丹明6G，以含5％葡萄糖的PBS重懸酵母菌進行泵出試驗，振蕩培養(yǎng)30min后流式細胞儀定量檢測酵母菌細胞內(nèi)剩余的熒光信號，記錄為羅丹明6G剩余熒光值。吸收值減去剩余熒光值即為羅丹明6G的泵出量。
　　4.實時熒光定量PCR檢測17-β-雌二醇對CDR1和CDR2表達的影響
　　酵母菌細胞液體培養(yǎng)基中加入

5、10-5M和10-10M17-β-雌二醇處理；酵母RNA提??；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)；實時熒光定量PCR檢測。
　　結(jié)果:
　　1.氟康唑的MIC值隨17-β-雌二醇濃度的升高（10-9M-10-5M）而增加，且均大于陰性對照組。在10-10M-10-5M17-β-雌二醇組特康唑的MIC值無明顯差異，稍大于陰性對照組。
　　2.相對陰性對照組10-5M17-β-雌二醇組羅丹明6G的泵出量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0

6、.05)。
　　3.10-5M和10-10M17-β-雌二醇組，CDR1和CDR2表達量高于陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，10-5M與10-10M17-β-雌二醇組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　本研究通過微量稀釋法證實了17-β-雌二醇可以增加白假絲酵母菌對氟康唑的耐藥性，同時利用流式細胞術(shù)和實時熒光定量 PCR分別在細胞水平和分子水平上證明了17-β-雌二醇上調(diào)藥物外排泵。由此提出