弓形蟲致密顆粒蛋白24和25的基因序列分析及免疫保護(hù)性研究.pdf

1、剛地弓形蟲（T.gondii）是一種重要的人獸共患寄生性原蟲。作為一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，弓形蟲可入侵包括人類在內(nèi)的幾乎所有溫血?jiǎng)游锏挠泻思?xì)胞。全球約有三分之一的人群被感染，在中國約有8％的人口感染。弓形蟲感染可引起孕婦流產(chǎn)、胎兒畸形，免疫機(jī)能低下者甚至死亡，對(duì)人類的生命和健康造成了嚴(yán)重的影響；同時(shí)，其也給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，因無根治弓形蟲病的特效藥，故疫苗的研制備受關(guān)注。但尚未研制出現(xiàn)安全、高效的疫苗，因此，篩選弓形蟲

2、疫苗的候選抗原分子顯得尤為重要。
　　致密顆粒蛋白（dense granule proteins，GRAs）均是分泌排泄抗原（ESA），ESA均具有高度免疫源性，可通過抗體依賴或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。GRA24一旦分泌進(jìn)入宿主細(xì)胞，可持續(xù)性地引發(fā)宿主細(xì)胞的自身磷酸化和宿主細(xì)胞p38αMAP激酶的核易位。GRA24可控制弓形蟲在小鼠腸道中的感染能力。它還具有增加宿主趨化因子的分泌和調(diào)節(jié)弓形蟲速殖子早期復(fù)制的能力

3、。GRA24可刺激活化型T細(xì)胞增殖，促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答反應(yīng)。GRA25是弓形蟲至關(guān)重要的毒力因子之一，影響被弓形蟲感染的巨噬細(xì)胞中的趨化因子（CCL2和CXCL1）的產(chǎn)生。
　　本研究分別對(duì)來自于不同宿主和地理來源的弓形蟲分離株的GRA24和GRA25基因組序列進(jìn)行克隆，并對(duì)其遺傳變異情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明：經(jīng)PCR擴(kuò)增后，可明顯擴(kuò)增出目的片段948bp和6264/6261bp，與預(yù)期結(jié)果一致。G

4、RA24基因的核酸變異率僅有0.05-0.2%，使用ML和MP以及BI法所構(gòu)建的GRA24的系統(tǒng)發(fā)育樹，能夠?qū)⒌湫偷腎和III型分開，但不能將II型蟲株聚集在一起。GRA25基因的核酸變異率為0～4.4%，使用ML和MP法所構(gòu)建的GRA25的系統(tǒng)發(fā)育樹，不能區(qū)分弓形蟲基因I、II和III型蟲株。因此，GRA24和GRA25均不能作為有效的遺傳標(biāo)記用于研究弓形蟲的遺傳變異。
　　本研究構(gòu)建了基于GRA24和GRA25基因的核酸疫苗p

5、VAX-GRA24和pVAX-GRA25，并用其免疫昆明（KM）鼠，檢測了體液免疫和細(xì)胞免疫的相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果顯示：免疫組小鼠血清中的IgG和IgG1、IgG2a的含量都有明顯的上升；CD3+CD4+CD8?輔助性T細(xì)胞以及CD3+CD8+CD4? T細(xì)胞的含量明顯增高，細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-12和IL-23的含量明顯增加，說明pVAX-GRA24和pVAX-GRA25能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的Th1型細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答反應(yīng)