家蠶二分濃核病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)及病毒樣顆粒的研究.pdf

1、家蠶二分濃核病毒（BmBDV）原稱為家蠶濃核病毒Ⅱ型（Bombyx moriDensovirus typeⅡ，BmDNV-Ⅱ），致使家蠶罹患濃核癥，在發(fā)病的早期感染家蠶中腸柱圓筒狀細(xì)胞，在發(fā)病的后期也能感染杯狀細(xì)胞。BmBDV病毒粒子無囊膜，呈球形顆粒，球形粒子直徑大約在22 nm左右。BmBDV是由單鏈線性雙分子DNA(VD1和VD2)構(gòu)成，分別獨(dú)立包裝于病毒衣殼中。該病毒擁有獨(dú)立包裝的雙分子ssDNA基因組、并且自身編碼DNA聚合酶

2、，是首例二分DNA病毒。2012年國際病毒分類委員會(huì)專門為此設(shè)立了二分DNA病毒科，下設(shè)二分濃核病毒屬，并將BmBDV定為該屬的代表種。
　　由從蠶糞中純化的成熟病毒顆粒中含有7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，其中，主要結(jié)構(gòu)蛋白VP由VD1-ORF3編碼，次要結(jié)構(gòu)蛋白P133是由VD2-ORF1編碼。BmBDV的VD1-ORF3轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種成熟的mRNA，在純化的病毒粒子中檢測到了兩種不同分子量的VP蛋白（大小約為50kD），BmBDV通過何種方式表

3、達(dá)產(chǎn)生VP蛋白尚不清楚。另外，BmBDV病毒粒子的特征研究仍然處于初級(jí)階段，尚未得到病毒粒子精細(xì)的三維結(jié)構(gòu)。
　　因此為了進(jìn)一步了解BmBDV的VP蛋白的表達(dá)策略、檢測VP蛋白自組裝情況及獲得BmBDV病毒樣顆粒。本實(shí)驗(yàn)主要從一下三個(gè)方面進(jìn)行研究:(1)通過Western blot檢測BmBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP的序列特征及在宿主中的表達(dá)時(shí)相。(2)利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，分別構(gòu)建和表達(dá)Multibac-vp1和Multibac-v

4、p2，通過Western blot檢測蛋白的表達(dá)情況;(3)大量表達(dá)Multibac-vp1和Multibac-vp2，通過提取純化獲得大量BmBDV病毒樣顆粒，并進(jìn)行電鏡觀察，質(zhì)譜鑒定VLPs的構(gòu)成組分。通過對(duì)病毒蛋白主要結(jié)構(gòu)蛋白VP表達(dá)和組裝的研究為病毒VP蛋白的表達(dá)策略解析、病毒結(jié)構(gòu)的解析以及家蠶濃核病的防治奠定基礎(chǔ)。
　　1.BmBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP的序列特征及在宿主中的表達(dá)時(shí)相
　　VP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有大量

5、α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲，由延伸鏈所構(gòu)成的β折疊結(jié)構(gòu)與濃核病毒結(jié)構(gòu)蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)相似，可能也能夠構(gòu)成濃核病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP中經(jīng)典的β桶結(jié)構(gòu)。
　　對(duì)BmBDV的主要衣殼蛋白VP在家蠶中的表達(dá)時(shí)相進(jìn)行分析，病毒感染家蠶后36小時(shí)檢測到3種VP蛋白的表達(dá)，在感染72小時(shí)后進(jìn)入表達(dá)高峰期，在120h時(shí)，VP蛋白在中腸組織中的含量最高，感染120 h后，VP蛋白在中腸細(xì)胞中的含量減少，可能是由于大量中腸細(xì)胞破裂，大量成熟病毒粒子產(chǎn)

6、生并釋放，組織中的VP蛋白含量減少。
　　2.BmBDV結(jié)構(gòu)蛋白基因vp的真核表達(dá)
　　克隆BmBDV編碼VP蛋白的序列全長(BmBDV-vp1)及5'端截短（從第二個(gè)其起始碼子ATG開始即BmBDV-vp2）的序列。利用桿狀病毒Multibac表達(dá)系統(tǒng)在Sf9細(xì)胞中對(duì)這兩段序列進(jìn)行真核表達(dá)，并用Western blot分別檢測Multibac-vp1和Multibac-vp2的表達(dá)情況。顯示BmBDV-vp1表達(dá)產(chǎn)生了三個(gè)

7、蛋白大小分別約為55 kD、54 kD和51kD（蛋白VP1、VP1'和VP2），與病毒在家蠶組織中表達(dá)的三個(gè)蛋白大小相似，其中VP1和VP2分別與預(yù)測從ORF3第一個(gè)和第二個(gè)起始密碼子起始翻譯的蛋白大小一致。BmBDV-vp2表達(dá)產(chǎn)生了兩個(gè)蛋白，大小約為51kD(蛋白VP2)和37 kD，其大小分別與預(yù)測從ORF3第二個(gè)和第三個(gè)起始密碼子起始翻譯的蛋白大小一致。
　　3.BmBDV病毒樣顆粒的提取純化、結(jié)構(gòu)及其組分鑒定
　

8、　利用蔗糖密度梯度離心和氯化銫密度梯度離心對(duì)Multibac-vp1和Multibac-vp2表達(dá)的VP蛋白進(jìn)行純化，并通過透射電鏡，利用負(fù)染法觀察VP的自組裝VLP的情況并利用質(zhì)譜鑒定其組成。Multibac-vp1在Sf9細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生VP1、VP1'和VP2三個(gè)蛋白，都參與了病毒樣顆粒的組裝。同時(shí)Multibac-vp2在Sf9細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生的VP2和37 kD兩個(gè)蛋白，參與并自組裝為病毒樣顆粒。這兩種由不同的VP蛋白所組裝成的病