家蠶二分濃核病毒結(jié)構(gòu)蛋白P133基因的啟動(dòng)子活性分析.pdf

1、家蠶二分濃核病毒（Bombyx mori bidensovirus，BmBDV）歸屬于新設(shè)定的二分DNA病毒科，是一類(lèi)小的動(dòng)物二分DNA病毒。該病毒與家蠶濃核病毒Ⅰ型相似，病毒粒子為二十面體非囊膜包裹結(jié)構(gòu)，主要感染家蠶的中腸柱狀上皮細(xì)胞，并引發(fā)家蠶濃核癥。感染的幼蟲(chóng)主要表現(xiàn)為厭食、空頭和下痢等癥狀。而且在感染晚期幼蟲(chóng)的中腸后部顏色變?yōu)榈S色，蠶沙成串珠狀。BmBDV基因組包括兩個(gè)節(jié)段的單鏈DNA分子6.6kb(VD1)和6.0kb(VD

2、2)，獨(dú)立包裝于衣殼中。VD2含有兩個(gè)ORF，分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS3及次要結(jié)構(gòu)蛋白P133，目前針對(duì)VD2啟動(dòng)子活性及其基因表達(dá)調(diào)控的相關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道，而這些工作對(duì)于全面了解BmBDV基因表達(dá)調(diào)控有著重要的意義。
　　P133基因5'端非編碼區(qū)UTR長(zhǎng)度為666nt，包括524nt的基因組末端重復(fù)序列(ITR)。生物信息學(xué)分析表明，假定的轉(zhuǎn)錄起始基序Inr(TAGT)和TATA-box分別位于P133蛋白基因起始密碼子上游-8

3、nt和-33nt。在ITR區(qū)域內(nèi)還存在其他啟動(dòng)子特征性序列CAAT-box、GC-box等。根據(jù)TATA-box及編碼P133的ORF的位置，p133基因的啟動(dòng)子位于VD2遺傳圖距單位89位置，因此將調(diào)控p133基因表達(dá)的啟動(dòng)子稱(chēng)為P89。
　　為了分析P89的啟動(dòng)活性，我們克隆了p133基因5'端非編碼區(qū)666bp的序列。將啟動(dòng)子序列插入到pGL3-Basic構(gòu)建啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒，并利用雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析其啟動(dòng)子活性。結(jié)果顯示

4、，P89能在昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9、BmE、BmN和Hi5中啟動(dòng)螢光素酶的表達(dá)，在Hi5細(xì)胞中P89活性高于在其他幾種細(xì)胞系中的活性。參考生物信息學(xué)分析結(jié)果，構(gòu)建了一系列含不同截短片段的重組質(zhì)粒，并通過(guò)螢光素酶活性檢測(cè)來(lái)分析活性。熒光分析的結(jié)果表明，TATA-box是維持P89基礎(chǔ)活性的必須元件;TATA-box上游存在一個(gè)沉默子元件，缺失起始密碼子上游-268nt～-195nt區(qū)域，P89活性提高至基礎(chǔ)活性的7.15倍;然而，繼續(xù)缺失至-14

5、3nt，P89活性又恢復(fù)到基礎(chǔ)活性，說(shuō)明-195nt至-143nt區(qū)域賦予P89較高的啟動(dòng)子活性。為了查明BmBDV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白是否調(diào)控P89的活性，構(gòu)建了非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2以及NS3的瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒，與pGL3-P89以及內(nèi)參海參熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。蛋白的表達(dá)通過(guò)Western blotting確定。結(jié)果表明NS1和NS2可以反式激活啟動(dòng)子，分別使P89活性提高了15.5％和69.9％。本研究還比較分析了BmBDV所有基因