家蠶二分濃核病毒結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)分析.pdf

1、家蠶二分濃核病毒(Bombyx mori bidensovirus，BmBDV)是2012年國際病毒分類委員會(huì)批準(zhǔn)新創(chuàng)建的二分DNA病毒科的唯一代表種。家蠶二分濃核病毒是引發(fā)家蠶濃核癥、造成養(yǎng)蠶業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的重要病原之一。BmBDV是首例動(dòng)物二分DNA病毒，病毒粒子是無囊膜的正二十面體結(jié)構(gòu)，顆粒體直徑約22-24nm;BmBDV病毒基因組包括兩節(jié)段的單鏈DNA分子(VD1，6.6kb和VD2，6.0kb)分別包裝在兩種大小相同、結(jié)構(gòu)相

2、近的球形衣殼中;此外，BmBDV基因組還自身編碼一個(gè)B家族的DNA聚合酶PolB。BmBDV基因組中兩個(gè)基因編碼結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，主要結(jié)構(gòu)蛋白VPs由VD1-ORF3編碼，vp gene全長1500bp，是病毒衣殼蛋白的組成成分，與BmBDV病毒粒子的包裝相關(guān)，VP蛋白的jelly-roll樣8β-strands結(jié)構(gòu)域與細(xì)小病毒衣殼蛋白(CP)高度同源，NS1蛋白保守的S3H結(jié)構(gòu)域也同樣暗示BmBDV起源于細(xì)小病毒。與細(xì)小病毒相比很獨(dú)特的是，

3、BmBDV還編碼病毒另一個(gè)較大的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)---次要結(jié)構(gòu)蛋白SP，sp基因全長3483bp，SP蛋白理論分子量約為133kDa，與呼腸孤病毒科質(zhì)型多角體病毒BmCPV的結(jié)構(gòu)蛋白VP3高度同源，主要介導(dǎo)病毒粒子的進(jìn)入，sp基因只表達(dá)一種蛋白質(zhì)、豐度很低，屬于少量的結(jié)構(gòu)蛋白;而關(guān)于結(jié)構(gòu)蛋白的組成和VP蛋白的表達(dá)策略仍無定論。本實(shí)驗(yàn)首先通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)病毒粒子完整的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜;其次，共表達(dá)兩種結(jié)構(gòu)蛋白VP和SP，解析病毒粒子結(jié)構(gòu)蛋白

4、的自組裝情況;再次，通過突變vp基因的第二個(gè)起始密碼子，分析主要結(jié)構(gòu)蛋白VPs的表達(dá)策略。主要結(jié)果如下:
　　1.從感病家蠶中腸組織純化的病毒粒子作為實(shí)驗(yàn)樣本，通過二維電泳(2-DE)檢測(cè)完整的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，鑒定到六種BmBDV病毒粒子蛋白質(zhì)的肽指紋圖譜，分布在分子量50-55kDa，等電點(diǎn)(pI)6.5-7.1之間;再利用質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析所獲得的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，這6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白都是由主要衣殼蛋白基因vp ge

5、ne編碼的。與VPs蛋白的理論等電點(diǎn)相比，觀測(cè)值明顯發(fā)生酸性偏移，二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)解析還發(fā)現(xiàn)VP蛋白的Met163處發(fā)生了氧化修飾。該結(jié)果首次較為全面地揭示了結(jié)構(gòu)蛋白的組成情況。
　　2.利用桿狀病毒(Multibac)表達(dá)系統(tǒng)，共表達(dá)病毒粒子兩種結(jié)構(gòu)蛋白---VPs和SP。將構(gòu)建的重組病毒Multibac-vp-sp感染Spodoptera frugiperda(sf9)細(xì)胞，Western blot檢測(cè)到兩種結(jié)構(gòu)蛋白條帶

6、VPs(3種，50-55kDa)和SP(1種，133kDa)，透射電鏡(TEM)觀察經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化的VP和SP蛋白表達(dá)產(chǎn)物，可見自組裝的直徑22-24nm的病毒樣粒子顆粒VLPs。
　　3.通過基因定點(diǎn)突變技術(shù)將vpgene第二個(gè)起始密碼子AUG突變后的編碼序列插入AcMNPV桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，感染昆蟲細(xì)胞，在polh啟動(dòng)子的調(diào)控下重組表達(dá)VP2STm蛋白，Western blot未檢測(cè)到起始于第二個(gè)起始密碼子表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋