牛IL-18成熟蛋白基因的表達、生物學(xué)活性測定及其單克隆抗體的制備.pdf

1、白細胞介素-18(interleukin-18，IL-18)是Okamura等(1995)從小鼠肝臟中克隆獲得的。Nakamori等(2003)研究發(fā)現(xiàn)，IL-18在抗腫瘤、抗感染及免疫調(diào)節(jié)等方面有著重要的作用，具有免疫治療及免疫佐劑的作用，有潛在的應(yīng)用前景。同時，隨著奶牛業(yè)的發(fā)展，奶牛病特別是奶牛乳腺炎呈上升趨勢，迫切需要新型疫苗與疫苗佐劑的研發(fā)。鑒于此，本實驗室對牛白介素18(bovine interleukin-18，BoIL-1

2、8)進行了克隆表達，旨在探索利用BolL-18能促進機體免疫功能的特性，將其應(yīng)用于奶牛病的預(yù)防及臨床治療。本試驗針對如何獲得高效表達且具有生物學(xué)活性的BoIL-18蛋白及利用表達的蛋白如何制備BoIL-18單克隆抗體這些問題進行了探討，主要包括以下四部分： 第一部分：牛IL-18成熟蛋白基因的原核表達及生物學(xué)活性測定。 根據(jù)已發(fā)表序列，設(shè)計一對特異性引物，將編碼BoIL-18的成熟蛋白基因從重組質(zhì)粒pMDT-BoIL-1

3、8中進行PCR擴增，然后亞克隆到原核表達載體pGEX6p-1中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)BL21(DE3)感受態(tài)細胞中獲得重組菌株，將該重組菌在IPTG的誘導(dǎo)下進行表達，用SDS-PAGE、Western blot分析表達情況；用谷胱甘肽瓊脂糖(GST)親和層析樹脂對表達產(chǎn)物進行純化，分析純化產(chǎn)物的生物學(xué)活性。結(jié)果表明，BoIL-18重組菌經(jīng)0.3mmol/L IPTG誘導(dǎo)8h，SDS-PAGE電

4、泳分析獲得了一條表達條帶，分子量約為44KD，凝膠薄層掃描分析顯示，表達的蛋白占工程菌菌體總蛋白的31.8％；生物學(xué)活性測定表明，BoIL-18融合蛋白濃度大于0.10mg/L時，對外周血單個核細胞(PBMC)有明顯的增殖作用；BoIL-18融合蛋白濃度大于0.20 mg/L時，能誘導(dǎo)牛脾淋巴細胞產(chǎn)生IFN-γ，且隨著BoIL-18濃度的增加，對IFN-γ的誘生作用增強：BoIL-18融合蛋白誘導(dǎo)脾淋巴細胞產(chǎn)生的IFN-γ有抑制水泡性口

5、炎病毒(VSV)產(chǎn)生細胞病變的作用，且隨IFN-γ產(chǎn)生量的增加，對VSV病毒的抑制作用增加。 第二部分：牛IL-18成熟蛋白基因在昆蟲桿狀病毒表達載體中的表達及生物學(xué)活性測定。 根據(jù)已發(fā)表序列，設(shè)計一對特異性引物，將編碼BoIL-18的成熟蛋白基因從重組質(zhì)粒pMDT-BoIL-18中進行PCR擴增，然后亞克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac HTb中，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pFastBac HTb-BoIL18，將其轉(zhuǎn)化

6、至DH10Bac感受態(tài)細胞中得到重組Bacmid(Bacmid-BolL18)。在轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin的作用下，將Bacmid-BolL18轉(zhuǎn)染至草地貪夜蛾細胞(SPodoptera frugiperda 9，sf9)獲得重組桿狀病毒，然后將重組桿狀病毒感染sf9，感染后在不同時間收獲sf9細胞及培養(yǎng)上清，應(yīng)用SDS-PAGE電泳、Western blot分析表達情況：用Ni-NTA樹脂對表達產(chǎn)物進行純化，分析純化產(chǎn)物的生物學(xué)活

7、性。結(jié)果表明，BolL-18成熟蛋白基因在昆蟲細胞sf9中獲得了表達，表達的目的條帶分子量為26KD，經(jīng)薄層凝膠掃描分析證實，表達量占總蛋白的21.3％；生物學(xué)活性分析表明，BoIL-18蛋白濃度大于0.05 mg/L時，具有明顯加強PBMC的增殖的作用：當其濃度大于0.10 mg/L時，能誘導(dǎo)牛脾淋巴細胞產(chǎn)生IFN-γ，并且隨著BoIL-18蛋白濃度的增加，誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ的量隨之增加；通過誘導(dǎo)牛脾細胞產(chǎn)生IFN-γ，間接地抑制VS

8、V產(chǎn)生細胞病變，且隨IFN-vW生量的增加，對VSV病毒的抑制作用增加。 第三部分：BoIL-18單克隆抗體的制備。 本試驗將第一部分中獲得的BoIL-18的原核表達產(chǎn)物作為免疫抗原，免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾與骨髓瘤細胞sp2/0在PEG的作用下進行融合；將第二部分中獲得的BoIL-18在昆蟲細胞sf9中的表達產(chǎn)物作為篩選抗原，利用間接ELISA方法反復(fù)篩選，應(yīng)用有限稀釋法進行多次克隆化后，最終獲得了兩株可分

9、泌BoIL-18單克隆抗體的陽性細胞克隆。Westem．blot證實，獲得的單克隆抗體具有良好的特異性：間接ELISA試驗檢測單克隆抗體5G8和783的效價分別為1x10<'5>和1×10<'6>。對已經(jīng)凍存的雜交瘤細胞株分別在第3月復(fù)蘇，用間接ELISA檢測雜交瘤細胞株的抗體效價不變，表明所獲得的雜交瘤細胞株具有良好的穩(wěn)定性。兩株細胞克隆亞類均為IgG1。 第四部分：牛IL-18成熟蛋白基因在家蠶幼蟲中的表達。 設(shè)計一

10、對特異性引物，將編碼BoIL-18的成熟蛋白基因從重組質(zhì)粒pET-BoIL-18中進行PCR擴增，然后將其亞克隆至轉(zhuǎn)移載體pVL1393中，在轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin的作用下，與線性化的病毒Bm-BacPAK6 DNA共轉(zhuǎn)染家蠶細胞Bm5，用藍白斑法篩選出重組病毒BmBacPAK-BoIL-18，經(jīng)PER鑒定正確后將重組病毒接種至5齡家蠶幼蟲體內(nèi)，飼養(yǎng)一段時間，取家蠶血淋巴進行SDS。PAGE電泳分析與Western blot印跡測