細(xì)胞外RNA初步克隆分析及miRNA-483前體相互作用蛋白的篩選.pdf

1、RNA廣泛存在于生命活動(dòng)的各個(gè)過(guò)程，并在其中發(fā)揮著重要的功能。但是，人們對(duì)細(xì)胞外RNA(extracellular RNA，eRNA)還知之甚少。microRNA(miRNA)的發(fā)現(xiàn)使我們對(duì)基因表達(dá)調(diào)控有了一個(gè)全新的認(rèn)識(shí)，但是miRNA前體的加工途徑的精細(xì)過(guò)程還不是很清楚。 為了探索細(xì)胞外RNA的生物學(xué)功能，本研究以HepG2細(xì)胞為研究模型，通過(guò)RNA酶A的對(duì)細(xì)胞的離散作用及RNA抗體的細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了細(xì)胞表面RNA分子的

2、存在，研究了細(xì)胞培養(yǎng)液中RNA含量的變化。通過(guò)凍干法富集了細(xì)胞培養(yǎng)液中的RNA，并采用本室建立的RNA克隆方法對(duì)其進(jìn)行了克隆。同時(shí)我們利用酵母三雜交技術(shù)篩選了本室克隆出的新的microRNA-48前體的相互作用蛋白。本研究取得的具體進(jìn)展如下： 1．用RNA抗體細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)，證實(shí)了HepG2細(xì)胞表面存在RNA分子。 2．發(fā)現(xiàn)RNA酶A能使HepG2細(xì)胞離散，遷移能力增強(qiáng)，細(xì)胞表面?zhèn)巫阍黾印?3．檢測(cè)了HepG2

3、細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液中和細(xì)胞表面RNA含量的變化。 4．建立了凍干濃縮提取細(xì)胞培養(yǎng)液中RNA的方法，并建立了細(xì)胞培養(yǎng)液RNA克隆方法，得到了若干條細(xì)胞培養(yǎng)液中的RNA，其中包括rRNA片段、人延伸因子1α亞單位、線粒體RNA片段和立克次氏體RNA，其中一條位于15號(hào)染色體CpG島區(qū)的28nt的RNA與新發(fā)現(xiàn)的piRNA有很高的相似性。 5．用酵母三雜交技術(shù)得到了microRNA-483前體候選相互作用蛋白，其中C140F

4、R108和ZNF43得到了回轉(zhuǎn)驗(yàn)證。 RNA在生命活動(dòng)中的作用已經(jīng)得到了人們的認(rèn)可。細(xì)胞外RNA的研究也已經(jīng)初見(jiàn)端倪，本研究以證實(shí)了細(xì)胞外RNA的存在，建立了細(xì)胞外液RNA的提取和克隆方法，獲得了一些有特點(diǎn)的RNA；為細(xì)胞外RNA的研究建立了新的方法?？梢杂糜诩膊〉臋z測(cè)，同時(shí)為深入研究RNA在生命活動(dòng)過(guò)程中的作用奠定了良好的基礎(chǔ)。通過(guò)酵母三雜交技術(shù)篩選了與microRNA-483相互作用的蛋白質(zhì)，為microRNA-483的加工