抗病小麥中與大麥黃矮病毒CP蛋白和RdRp復(fù)制酶相互作用蛋白的研究.pdf

1、黃矮病是由大麥黃矮病毒(barley yellow dwarf virus,BYDV)引起的小麥重要病毒病.本研究組已將源于中間偃麥草的抗黃矮病基因整合到小麥基因組中,創(chuàng)建了一系列抗黃矮病小麥一中間偃麥草易位系,如HW642,可抑制BYDV的復(fù)制與運動.為明確抗黃矮病小麥易位系中哪些蛋白與BYDV致病相關(guān)蛋白相互作用,本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng),從HW642的cDNA文庫中分離出與BYDV外殼蛋白(coat proitein,CP)和復(fù)制

2、酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)相互作用的蛋白,對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測和表達(dá)分析,取得以下結(jié)果.1.利用含有酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4 DNA結(jié)合域(DNA binding domain,BD)的載體pGBKT7,構(gòu)建了BYDV-GAV的CP和RdRp全長基因的酵母雙雜誘餌載體pGBKT7-CP和pGBKT7-RdRD,并轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)分析.結(jié)果表明,pGBKT7-CP和pGBKT7-RdRp所表達(dá)的融

3、合蛋白對酵母細(xì)胞沒有毒害作用,且自身沒有激活性,可作為酵母雙雜系統(tǒng)的誘餌載體.2.利用SMART(swi tching mechanism At 5'end of the RNA transcript)技術(shù)構(gòu)建抗黃矮病易位系HW642的酵母雙雜交cDNA文庫.該文庫包含80萬個轉(zhuǎn)化子,均含有酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的轉(zhuǎn)錄激活域(activation domain,AD),重組率達(dá)88﹪,插入片段大小為0.2-1.4kb,滴度為3×10<'7

4、>CFU/ml.3.利用酵母雙雜交系統(tǒng),以pGBKT7-CP為誘餌,篩選HW642的酵母雙雜交cDNA文庫.兩次篩庫,分別獲得155個和144個候選陽性克隆.通過兩輪高嚴(yán)謹(jǐn)度的篩選,從第二次篩庫所得候選陽性克隆中,鑒定出一個能夠在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trip培養(yǎng)基上生長,與CP相互作用的克隆WY65,其插入片段編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Serine/Threonine kinase,STK)部分序列,將該基因命名為T

5、aSTK1.進(jìn)一步的β-半乳糖苷酶活性定量分析和載體互換實驗證實,酵母中表達(dá)的TaSTK1融合蛋白與大麥黃矮病毒外殼蛋白間相互作用是特異的.采用巢式PCR策略和5'RACE(rapid amplification of cDNA ends)技術(shù),從HW642中分離出TaSTK1基因全長cDNA序列.4.推測的TaSTK1蛋白由460個氨基酸組成,其N端含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的保守結(jié)構(gòu)域.在小麥中尚未發(fā)現(xiàn)與之同源的蛋白.二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯

6、示,TasTKl蛋白由21個α螺旋,19個β鏈和29個拐角組成.PROSITE軟件分析結(jié)果顯示,TaSTK1具有2個與ATP結(jié)合的結(jié)構(gòu)和1個質(zhì)子受體相關(guān)活性位點.利用SWISS-MODEL預(yù)測了TaSTK1蛋白的高級結(jié)構(gòu).上述結(jié)果表明,TaSTK1是具有活性功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶.5.利用實時定量PCR對TaSTK1基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)大麥黃矮病毒侵染抗病小麥易位系HW642后,能夠提高TaSTK1基因的表達(dá)量,與此相反,

7、大麥黃矮病毒侵染感病小麥后則抑制該基因的表達(dá),表明TaSTK1在抗黃矮病反應(yīng)中具有重要作用.6.利用酵母雙雜交系統(tǒng),以pGBKT7-RdRp為誘餌,篩選酵母雙雜交cDNA文庫,從同一個克隆里分離出2個質(zhì)粒,分別命名為P500和P350,P500編碼生長素應(yīng)答因子(auxin.response factors,ARF)類蛋白的部分序列,P350編碼1個未知蛋白.P500、P350和pGBKT7-RdRp三者個共同轉(zhuǎn)化酵母能激活報告基因的表