大麥黃矮病毒和蚜蟲誘導(dǎo)的小麥防御基因的分離及基因沉默體系的建立.pdf

1、本文首先通過半定量RT-PCR的方法，研究了BYDV-GAV在YW642及其感病姊妹系植株中，在時間和空間上積累的差異，在分子水平上證明了YW642對BYDV的高度抗性。結(jié)果還表明，抗病植株在病毒侵染后誘導(dǎo)防御基因表達(dá)的大致時間在接種飼毒蚜48小時-72小時之前，為從抗病植株中分離防御反應(yīng)基因、研究抗病基因表達(dá)譜提供了取樣的依據(jù)。 構(gòu)建了飼BYDV-GAV蚜蟲誘導(dǎo)的SSH文庫。從該SSH文庫中篩選出22個雜交信號差異顯著的克隆。

2、利用半定量RT-PCR進(jìn)一步驗證，確證其中6個為蚜蟲誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的cDNA克隆，其中有3個分別與圓錐小麥基因組上不同位點(diǎn)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列有94％、93％和87％的一致性，另外3個cDNA克隆分別與普通小麥的PR-4基因有97％的一致性、與β-1，3-葡聚糖酶基因有94％的一致性以及與大麥的低溫反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白基因有91％的一致性。本研究分離的6個cDNA克隆都是對蚜蟲應(yīng)答反應(yīng)的基因，這為闡明小麥對蚜蟲的防御機(jī)制，進(jìn)一步克隆小麥中蚜蟲

3、誘導(dǎo)型啟動子奠定了基礎(chǔ)。 以接種飼毒蚜48小時、72小時和接種無毒蚜48小時、72小時的YW642樣品被首先作為研究對象。通過cDNA-AFLP方法，篩選出YW642被BYDV誘導(dǎo)表達(dá)的片段109個，然后在此基礎(chǔ)上，加入感病姊妹系接種飼毒蚜48小時、72小時樣品同時再次進(jìn)行cDNA-AFLP分析，以排除小麥遺傳背景對BYDV的本能防御反應(yīng)。最后分離到12個BYDV誘導(dǎo)的、特異性地在抗病植株中表達(dá)的基因片段。反向Northern分

4、析驗證了其中的兩個基因片段。對驗證的兩個基因片段進(jìn)行Southern分析，結(jié)果表明其中一個基因在抗感小麥基因組中都存在，并且為單拷貝，序列分析表明可能代表的是新基因。這是第一次分離到在抗黃矮病小麥中被BYDV誘導(dǎo)表達(dá)的基因片段，為揭示小麥抗黃矮病機(jī)制打下了良好的基礎(chǔ)。 利用病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)的載體系統(tǒng)，首次在小麥上建立了病毒誘導(dǎo)的基因沉默體系，確定了第四葉是基因沉默效果最佳的部位。小麥基因沉默體系的建立為快速分析小麥及