hpRNA和pac1基因介導(dǎo)抗大麥黃矮病毒轉(zhuǎn)基因小麥研究.pdf

1、本文從進一步提高對BYDV的特異抗性和病毒廣譜抗性兩個方面入手進行小麥轉(zhuǎn)基因研究，希望獲得高抗BYDV的轉(zhuǎn)基因小麥植株和具有廣譜病毒抗性的轉(zhuǎn)基因小麥。 在提高對BYDV抗性的轉(zhuǎn)基因小麥研究方面，利用BYDV-GPV株系的復(fù)制酶基因(Rep)片段和外殼蛋白基因(CP)片段構(gòu)建成可表達復(fù)合發(fā)夾RNA(hpRNA)——含有由Rep片段雙鏈(CP雙鏈)RNA構(gòu)成的莖和反義CP(反義復(fù)制酶片斷)RNA構(gòu)成的環(huán)——的表達框架，將該框架分別連

2、入含有CaMV35S啟動子和Emu啟動子的真核表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(轉(zhuǎn)35S：CP+/Rep-/CP-結(jié)構(gòu))、基因槍法(轉(zhuǎn)Emu：Rep+/CP-/Rep-結(jié)構(gòu))和花粉管通道法(分別轉(zhuǎn)Emu：Rep+/CP-/Rep-和Emu：CP+/Rep-/CP-結(jié)構(gòu))對小麥進行遺傳轉(zhuǎn)化，基于該結(jié)構(gòu)表達的hpRNA誘發(fā)植物體內(nèi)針對病毒基因組不同部位的RNA干擾機制而達到特異性高度抗病毒的目的。實驗結(jié)果表明：①在農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的82株G418

3、抗性植株中有75株P(guān)CR結(jié)果呈陽性；經(jīng)過第一次病毒抗性試驗，有59株未發(fā)病或只有輕微癥狀；Dotblot檢測表明59株抗性植株中有46株整合有外源基因；ELISA結(jié)果表明整合有外源基因的植株中有37株能夠正常表達外源基因；Southernblot結(jié)果表明外源基因在小麥體內(nèi)多以雙拷貝形式存在；第二次病毒抗性試驗表明，在Dotblot、ELISA呈陽性的37株再生植株中有14株表現(xiàn)低度抗性，有12株表現(xiàn)中度抗性，有10株表現(xiàn)高度抗性，另外1

4、株在實驗過程中死亡。②在基因槍法轉(zhuǎn)化中，因未使用標記基因，故應(yīng)用改進的葉片快速PCR對再生幼苗在生根階段進行篩選，共移栽成活64株快速PCR陽性植株；經(jīng)第一次病毒抗性試驗有30株表現(xiàn)抗性，Dotblot結(jié)果表明其中21株整合有外源基因；經(jīng)第二次病毒抗性試驗，21株Dotblot陽性植株中有5株表現(xiàn)低度抗性，有8株表現(xiàn)中度抗性，有8株表現(xiàn)高度抗性。③通過花粉管通道法獲得轉(zhuǎn)Emu：Rep+/CP-/Rep-結(jié)構(gòu)的種子367粒，獲得轉(zhuǎn)Emu：

5、CP+/Rep-/CP-結(jié)構(gòu)的種子545粒；對T1代幼苗進行大田抗病性鑒定結(jié)果表明，有2株轉(zhuǎn)Emu：CP+/Rep-/CP-結(jié)構(gòu)小麥植株在接毒40天后仍沒有明顯發(fā)病癥狀。 在提高病毒抗性譜方面，利用克隆自粟酒酵母的pac1基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥。該基因是一種RNA雙鏈分解酶。由于大多數(shù)植物病毒為RNA病毒，不管其基因組是單鏈還是雙鏈，在寄主體內(nèi)復(fù)制過程都會有一個雙鏈RNA中間體階段，如果通過基因工程手段將pac1基因轉(zhuǎn)入植

6、物體，利用其降解病毒dsRNA的活性而阻斷病毒復(fù)制過程，就有可能達到抗植物病毒病的目的。并且pac1的作用靶位點只針對RNA雙鏈，對RNA的序列無特殊要求，這就擴大了其對病毒抗性譜。本轉(zhuǎn)化試驗共獲得41株G418抗性植株；經(jīng)第一次病毒抗性試驗獲得30株抗性植株；其中27株P(guān)CR和Dotblot結(jié)果呈陽性；ELISA和RT-PCR結(jié)果表明27株整合有外源基因的再生植株中有25株能夠正常表達外源基因；經(jīng)第二次病毒抗性試驗，獲得12株低度抗性

7、植株，12株中度抗性植株，1株高度抗性植株。對于轉(zhuǎn)pac1基因小麥能否對其他小麥病毒表現(xiàn)抗性、真正達到廣譜抗病毒的目的，我們將在后續(xù)的工作中做進一步研究。 最后，針對構(gòu)建hpRNA時需要多次連接反應(yīng)的問題，設(shè)計了一個含有新型表達框架的雙元載體，只要通過1步連接反應(yīng)既可構(gòu)建完成可表達目的基因dsRNA的真核表達載體。以轉(zhuǎn)有綠色熒光蛋白的煙草中的GFP為沉默目的基因，通過農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)化技術(shù)成功地沉默了煙草中的GFP，這就證實了該載體