Api6蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)建立及其功能的初步研究.pdf

1、目的：凋亡抑制因子6（Apoptosis Inhibitor6，Api6）也叫作AIM、Spα或CD5L，是清道夫受體富含半胱氨酸殘基家族新成員。近年來(lái)Api6在細(xì)菌感染、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝和腫瘤發(fā)生中的作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注。本課題擬采用蛋白原核表達(dá)的方法，誘導(dǎo)表達(dá)人Api6融合蛋白，為進(jìn)一步研究Api6在脂質(zhì)代謝和腫瘤發(fā)生中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　材料與方法：
　　1.PCR體外擴(kuò)增人Api6 cDNA全長(zhǎng)，產(chǎn)物回收純化

2、，經(jīng)T4 DNA連接酶16℃連接構(gòu)建入原核表達(dá)載體ppSUMO，經(jīng)BamH I-HF/Hind III雙酶切電泳鑒定和DNA測(cè)序鑒定，獲得可以表達(dá)Api6基因的重組質(zhì)粒ppSUMO-Api6。
　　2.重組質(zhì)粒ppSUMO-Api6經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化原核表達(dá)宿主菌E.coli Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡拉抗性篩選、BamH I-HF/Hind III雙酶切電泳鑒定和DNA測(cè)序鑒定，構(gòu)建重菌ppSUMO-Api6-Rosetta。

3、
　　3.采用蛋白原核表達(dá)的方法，不同誘導(dǎo)前菌液濃度，不同溫度、不同IPTG濃度、不同誘導(dǎo)時(shí)間，篩選誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白ppSUMO-Api6的最優(yōu)條件。
　　4.100μg/ml ox-LDL處理人肺腺癌細(xì)胞A54924h致細(xì)胞凋亡，同時(shí)加入重組蛋白ppSUMO-Api6處理細(xì)胞24h，觀察細(xì)胞凋亡的改變。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒ppSUMO-Api6。
　　2.成功構(gòu)建重組菌ppSUMO-Ap

4、i6-Rosetta。
　　3.誘導(dǎo)重組蛋白ppSUMO-Api6原核表達(dá)的最優(yōu)條件為：OD600=0.5～0.8的重組菌，16℃、0.5mM IPTG誘導(dǎo)ppSUMO-Api6-Rosetta16h。
　　4.與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白ppSUMO-Api6可以使ox-LDL所致A549細(xì)胞的凋亡下降10%（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　含有人Api6 cDNA全長(zhǎng)序列的重組質(zhì)粒ppSUMO-Api6