慢性心力衰竭尿液蛋白標記物的篩選、鑒定及應用研究.pdf

1、研究背景：慢性心力衰竭(CHF)是由于心臟器質性或者功能性疾病損害心臟射血和充盈能力而引起的一組臨床綜合征，以心功能不全、神經內分泌激活和外周血流分布異常為主要特征。慢性心衰是各種病因導致心血管疾病的嚴重階段，其患病率高，死亡率大，5年存活率與惡性腫瘤相仿，嚴重威脅著患者生命并嚴重影響患者生活質量，高額的治療費用給社會經濟造成了巨大的負擔，成為一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。缺乏客觀診斷標準是心衰死亡率高的原因之一，慢性心力衰竭至今尚無診斷的“

2、金標準”，診斷心衰很大程度取決于醫(yī)生個人臨床判斷，主要依據(jù)臨床癥狀和體征。目前公認的NYHA分級是最常用的評價心衰嚴重程度，預測心衰預后的心功能分級系統(tǒng)，但其評價依據(jù)是以病人自覺癥狀為主，其診斷的準確率受到醫(yī)生進行臨床判斷的主觀影響，同時也與醫(yī)生的從醫(yī)經驗和患者的配合度相關。目前無創(chuàng)的客觀檢查手段如超聲心動圖所能檢測的LVEF雖有較大診斷價值，但只能起參考作用。尋找能夠反映心衰這一病理生理狀態(tài)的客觀指標是當前面臨的主要問題。心衰是一種慢

3、性和發(fā)展性疾病，促發(fā)心衰的因素有很多，根據(jù)神經激素學說及炎性細胞學說，我們找到了以BNP/NT-proBNP，炎癥細胞因子（如C反應蛋白，腫瘤壞死因子-α），心肌損傷標記物（如肌鈣蛋白）為代表的一系列新的標志物，推動了整體心血管疾病診治水平的提高;因此有必要在生命活動的直接執(zhí)行者蛋白質領域上，尋找敏感性高、特異性好的蛋白生物分子標志物。心力衰竭可由多種病理因素引起，在病理情況下蛋白質的變化也是多種多樣的。心力衰竭直接相關的分子和細胞改變

4、與臨床上心功能受損、療效、衰竭進程和患者預后的關系并沒有確定，不同病因引起的心力衰竭疾病過程，臨床表現(xiàn)，預后也有差異，這些差異必然是由其不同的蛋白質特征決定的。直接對心力衰竭過程中蛋白組學的研究是揭示細胞生命本質特征的重要方案，有助于了解心衰時心肌細胞功能障礙及代償作用的分子機制。本研究采用熒光差異雙向凝膠電泳(2D-DIGE)蛋白質組學方法結合質譜技術篩選并鑒定慢性心力衰竭和正常人群尿液差異表達蛋白質，并對候選差異表達蛋白質進行驗證及

5、進一步的研究。探討慢性心衰的發(fā)生發(fā)展機制，尋找慢性心衰特異性分子標記物，為其早期診斷，監(jiān)測預后及尋求新的治療靶點提供研究依據(jù)。
　　 第一部分慢性心力衰竭患者尿液雙向凝膠電泳圖譜的構建
　　 1.目的:構建穩(wěn)定性好，重復率及分辨率高的慢性心力衰竭尿液蛋白雙向電泳圖譜，為尿液蛋白組水平進一步研究慢性心力衰竭奠定基礎。
　　 2.材料和方法:隨機選取慢性心力衰竭患者9例，其中心功能分級Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ級的心衰患者各3例。標

6、本來源于南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院心血管內科，明確診斷為慢性心衰的患者?；颊呒{入標準按照Framingham Heart Study(FHS)的慢性心力衰竭診斷標準。慢性心衰患者心衰嚴重程度按照美國紐約心臟學會(NYHA)分級法分級。囑咐符合納入標準的患者留取入院后前兩天清潔中段晨尿，留取后立即冷卻4℃，隨后移到-80℃儲存。將尿液樣本用丙酮或TCA/丙酮沉淀法提取，純化，濃縮蛋白，并用2D-Quant方法測定蛋白質濃度。隨后按照雙向電泳手冊

7、進行操作。上樣樣品分為四組:取100μg蛋白樣品丙酮處理組(IPG pH3-10NL，24cm)，100μg蛋白樣品TCA/丙酮處理組(IPG pH3-10NL，24cm)，100μg蛋白樣品聚焦60 KVh組(IPG pH3-10NL，24cm)和100μg蛋白樣品聚焦50 KVh組(IPG pH3-10NL，24cm)。第一向為等電聚焦，聚焦完畢后用平衡液平衡兩次，隨后膠條移至濃度為10.0％的SDS-PAGE膠上端進行二向電泳，直

8、至溴酚藍達膠底線。按照固定、敏化、水洗、銀染、水洗、顯色、終止的步驟對電泳膠染色。用投射掃描儀進行膠圖掃描，獲取2-DE凝膠圖像。
　　 3.結果
　　 1)對比聚焦總伏特數(shù)50 KVh組;聚焦總伏特數(shù)60 KVh組的電泳圖譜上不僅蛋白點較多，而且橫條紋也大大減少，分離效果較好。
　　 2)使用TCA/丙酮沉淀法較丙酮沉淀法的整個圖譜效果明顯好，背景干凈，清晰，圖譜的橫，豎條紋均較少，且圖上的蛋白質點能夠清晰分辨

9、，以便進行差異點的辨認和鑒定等后續(xù)實驗。
　　 4.結論:尿液樣本采用TCA/丙酮沉淀法處理，第一向電泳聚焦60KVh的總伏特數(shù)能夠得到穩(wěn)定性好，分辨率高、重復性好的雙向電泳圖譜，為進一步從尿液蛋白組水平篩選出慢性心力衰竭相關蛋白研究奠定了實驗基礎。
　　 第二部分慢性心力衰竭患者尿液表達變化蛋白質的分離、篩選及鑒定
　　 1.目的:利用2D-DIGE和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜鑒定技術對慢性心力衰竭組和正

10、常對照組尿液中的差異蛋白質進行分離，篩選及鑒定，為進一步尋找敏感性高、特異性好的慢性心衰蛋白生物分子標志物奠定基礎。
　　 2.材料和方法:本部分研究共納入正常對照組和慢性心力衰竭組尿液標本各15例，其中心功能分級為Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ級的心衰患者各5例。慢性心力衰竭患者尿液標本收集同第一部分。正常對照組標本來源于南方醫(yī)院體檢中心健康受試者的清潔中段晨尿。入選標準為:既往體健，無長期服藥史，無重大疾病史的志愿者，無近期感染史，無吸毒及嗜酒

11、史。采用標本混合法，提取兩組尿液總蛋白并定量后進行熒光染料標記，Cy2標記內標樣品，Cy3標記正常對照組尿液蛋白樣品，Cy5標記慢性心力衰竭尿液蛋白樣品。待樣品標記好后進行雙向電泳過程。電泳結束后，標記有熒光染料的凝膠直接用Typhoon9410掃描儀掃描，獲取圖譜后用Decyder凝膠分析軟件進行分析。挑選出28個兩組間具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)并且差異倍數(shù)＞1.5倍的顯著增加或者顯著減少的感興趣差異蛋白點進行質譜鑒定。利用考馬斯

12、亮藍染色的制備膠上對應的差異點進行質譜鑒定。
　　 3.結果
　　 1)成功利用熒光差異雙向電泳方法對慢性心力衰竭和正常對照兩組的尿液蛋白進行分離，篩選并獲得滿意的熒光差異雙向電泳圖譜。
　　 2)運用Decyder凝膠分析軟件對分析后，挑選出慢性心力衰竭和正常對照兩組28個差異倍數(shù)＞1.5倍的差異蛋白點作為質譜鑒定的對象。
　　 3)共鑒定出20種不同的蛋白質。在慢性心力衰竭組中7個升高表達的蛋白分別是

13、:鈣粘蛋白-1(CDH1)，鋅α2糖蛋白(AZGP1)，α1-酸性糖蛋白(ORM1)，人α1微球蛋白(AMBP)，免疫球蛋白1κ鏈C區(qū)(IGKC)，人免疫球蛋白輕鏈kappa(IGLC1)，GM2神經節(jié)苷脂激活因子(GM2A);13個下調表達的蛋白分別是:尿調節(jié)素(UMOD)，激肽原-1(KNG1)，α1-淀粉酶(AMY1A)，維生素D結合蛋白(GC)，胰腺α-淀粉酶(AMY2A)，血清白蛋白(Serum albumin，ALB)，白細

14、胞彈性蛋白酶抑制劑(SERPINB1)，間-α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4(ITIH4)，凝血酶原(F2)，鈣結合蛋白(CALB1)，硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白(HSPG2)，甘露聚糖結合凝集素絲氨酸蛋白酶2(MASP2), CD59糖蛋白(CD59)。
　　 4.結論:順利利用熒光差異雙向電泳對慢性心力衰竭和正常對照兩組的尿液蛋白進行分離，篩選及分析差異蛋白點，并成功鑒定出20種不同的蛋白質，7個蛋白質在慢性心力衰竭尿液中高表達

15、，13個低表達。為尋找敏感性高、特異性好的慢性心衰潛在的蛋白生物分子標志物提供了重要的研究基礎。
　　 第三部分差異蛋白ORM1在慢性心力衰竭的臨床意義研究
　　 1.目的:在鑒定的20個差異蛋白中選取與慢性心力衰竭特異相關的尿液候選蛋白，并研究該候選蛋白與慢性心力衰竭疾病的聯(lián)系。
　　 2.材料與方法:首選利用生物信息學工具對鑒定的20個差異蛋白進行分析，系統(tǒng)、科學地分析這些鑒定蛋白質累積信息所蘊含的生物學意義

16、。根據(jù)生物信息學分析選定ORM1為候選蛋白。利用western blotting技術驗證ORM1在尿液中的表達，驗證其可靠性后，對62例正常對照組和176例慢性心力衰竭患者的尿液標本用ELISA方法檢測ORM1蛋白濃度，其中Ⅱ級患者34例，Ⅲ級患者87例和Ⅳ級心衰患者55例。標本來源于南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院心血管內科，明確診斷為慢性心衰的患者?；颊呒{入標準按照Framingham Heart Study(FHS)的慢性心力衰竭診斷標準。慢

17、性心衰患者嚴重程度按照美國紐約心臟學會(NYHA)分級法分級。正常對照組標本來源于南方醫(yī)院體檢中心健康受試者的清潔中段晨尿。定量檢測后，運用ROC曲線分析尿液ORM1/Cr用來診斷慢性心力衰竭的臨界值及對應的特異度和敏感度。此外，根據(jù)納入ELISA研究慢性心力衰竭患者臨床資料如:年齡，性別，伴有或無糖尿病，伴有或無高血壓，伴有或無冠心病，伴有或無心肌病，伴有或無腎功能損害，eGFR分級，NT-proBNP和和LVEF≥或＜50％等進行分

18、析，進一步分析ORM1與慢性心力衰竭之間的關系。
　　 3.結果
　　 1)生物信息學提示這20個差異蛋白共參與了1600個不同的生物學過程，其中前15個生物學過程包括:生長，誘導，信號轉導，發(fā)病機制，分泌，消化，定位，翻譯，凝血，死亡，RNA剪接，細胞凋亡，磷酸化和補體激活等。
　　 2)生物信息學分析及文獻挖掘提示ORM1可作為候選蛋白進一步研究。
　　 3) ORM1尿液western blotti

19、ng結果與蛋白質組學結果一致，在慢性心力衰竭中高表達。
　　 4)慢性心力衰竭組的ORM1/Cr水平為6498.83±4300.21 ng/mg，顯著高于健康對照組2102.256±1069.24 ng/mg。當ORM1/Cr為2484.98ng/mg水平，用其診斷慢性心力衰竭的敏感度為90.91％，特異度為85.48％。
　　 5)慢性心力衰竭的嚴重程度分組，Ⅱ級，Ⅲ級和Ⅳ級心衰患者尿液中ORM1/Cr水平有顯著性差異

20、，濃度依次分別為:3086.24±1474.91 ng/mg，6284.97±4088.02 ng/mg和8946.71±4298.05 ng/mg; Spearman檢驗提示其相關系數(shù)為0.499，尿液中ORM1水平隨著心衰程度的加重而升高。
　　 6)慢性心力衰竭患者臨床資料的分析中，未發(fā)現(xiàn)年齡，性別，伴有或無糖尿病，伴有或無高血壓，伴有或無冠心病，伴有或無心肌病，伴有或無腎功能損害，eGFR分級和LVEF≥或＜50％等分組