細胞治療生長板損傷的研究.pdf

1、第一部分兔髂嵴軟骨細胞分離及提純的實驗研究
　　目的：建立一種簡單可靠的軟骨細胞體外分離和純化的方法。
　　方法：將2只幼齡新西蘭兔心臟空氣栓塞處死后,無菌操作下取得髂嵴部位的軟骨塊,修剪成1~2mm2組織塊,經(jīng)0.1％透明質(zhì)酸酶、0.25%胰蛋白酶和0.1%II型膠原蛋白酶三步法消化濾過后獲得軟骨細胞懸液,再經(jīng)臺盼藍染色檢測活細胞存活率后,接種到含10%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)細胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶

2、中進行原代培養(yǎng)。
　　結果：取材兔髂嵴軟骨經(jīng)三步酶消化法后可獲得多量的單個軟骨細胞,具有良好的細胞活性。
　　結論：此方法是一種簡單可靠的軟骨細胞分離純化方法,可進一步通過原代培養(yǎng)擴增后用于軟骨或生長板損傷修復的各種基礎研究。
　　第二部分兔髂嵴軟骨細胞原代培養(yǎng)及鑒定的實驗研究
　　目的：建立一種簡便可靠的軟骨細胞體外原代培養(yǎng)的方法。
　　方法：將2只幼齡新西蘭兔心臟空氣栓塞處死后,無菌操作下取得髂嵴部位的

3、軟骨塊,修剪成1~2mm2組織塊,經(jīng)0.1%透明質(zhì)酸酶、0.25%胰蛋白酶和0.1%II型膠原蛋白酶三步法消化濾過后獲得軟骨細胞懸液,接種到含10%FBS細胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板中進行原代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察軟骨細胞生長狀態(tài),軟骨細胞計數(shù)法繪制生長曲線,甲苯胺藍染色、II型膠原免疫組織化學染色和透射電鏡觀察鑒定培養(yǎng)的軟骨細胞。
　　結果：軟骨細胞接種后24h基本貼壁生長,向四周伸出偽足,呈梭形、三角形或多角形。培養(yǎng)第3~5

4、天增殖活躍,呈細胞島樣結構,培養(yǎng)第7天增殖漸停滯,呈結節(jié)狀的鋪路石樣外觀。甲苯胺藍染色,細胞質(zhì)呈藍色,伴深藍色顆粒,長期培養(yǎng)細胞漿嚴重空泡化,胞漿體積增大,越接近結節(jié)中間越明顯;II型膠原免疫組織化學染色,細胞漿呈淡棕色,伴棕色顆粒;透射電鏡下觀察,核大居中,細胞漿內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富,部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張。
　　結論：此方法是一種簡便可靠的軟骨細胞原代培養(yǎng)方法,培養(yǎng)的軟骨細胞具有良好的細胞活性和穩(wěn)定的特征性生物表型,可進一步用于自體移

5、植重塑修復軟骨或生長板損傷的實驗研究。
　　第三部分兔脛骨近端生長板損傷模型構建的實驗研究
　　目的：建立一種簡單可靠的動物生長板損傷實驗模型的方法。
　　方法：將1只幼齡新西蘭兔腹腔麻醉后,無菌操作下用針頭刺入破壞雙側脛骨近端生長板。陰性對照組未行手術操作。放射學觀察生長板損傷和修復情況。
　　結果：術后1周,手術組雙側脛骨近端生長板部位呈斑片狀模糊樣影,為局部炎癥表現(xiàn);術后6周,手術組雙側脛骨近端生長板中央部