人臍血間充質(zhì)干細胞源性的類許旺細胞與人胎兒坐骨神經(jīng)許旺細胞差異蛋白組學的研究.pdf

1、背景：周圍神經(jīng)損傷缺損的臨床治療是世界難題，自體神經(jīng)移植是金方法，但會造成供區(qū)神經(jīng)損傷。通過組織工程化的人工神經(jīng)修復周圍神經(jīng)缺損是當前臨床研究的熱點。人工神經(jīng)的種子細胞為SCs(Schwann cells,SCs)，其來源主要有自體SCs、異體SCs、以及由間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）定向誘導分化而來，而MSCs誘導而來的類SCs以其來源廣泛，活性強更受學者青睞。人臍血間充質(zhì)干細胞(Human

2、Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cells,HUCBMSCs)作為最先應用的人骨髓間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）的一種替代來源，在體外誘導培養(yǎng)中已證明其具有向 SCs分化的能力，但是其生物學行為和正常SCs有哪些異同之處還有待進一步研究。
　　目的：本研究旨在建立人胎兒坐骨神經(jīng)SCs的分離、培養(yǎng)、純化及鑒定體系，結(jié)合本課題組以往的HUCBMSCs培

3、養(yǎng)及體外誘導經(jīng)驗，將HUCBMSCs、HUCBMSCs體外誘導后的類SCs以及人SCs三種細胞進行蛋白質(zhì)組學的分析，尋找差異蛋白點。
　　方法：采用課題組既往HUCBMSCs培養(yǎng)及體外誘導方法獲得HUCBMSCs以及類SCs；取藥物引產(chǎn)的10具12~16周人胎兒胎坐骨神經(jīng)，剝離神經(jīng)外膜、剪碎、消化、離心、培養(yǎng)，待長滿瓶底后，分 A組采用低酶消化、差速貼壁以及 D-Valine條件培養(yǎng)基純化 SCs；B組采用低酶消化結(jié)合差速貼壁純化

4、法純化；C組采用D-Valine條件培養(yǎng)基純化法；D組不采用任何純化處理。根據(jù) SCs特有顯微鏡下形態(tài)統(tǒng)計各組細胞純度，選取純度最高的一組進行下一步實驗。提取這三種細胞的總蛋白，利用雙向凝膠電泳分離蛋白并銀染，利用ImageMaster軟件進行分析對比，選取HUCBMSCs與SCs相比表達低的點和HUCBMSCs誘導過程中增加的蛋白點之間的匹配點進行質(zhì)譜分析，并選取適當?shù)鞍走M行免疫印跡驗證。
　　結(jié)果：1）采用低酶消化、差速貼壁以

5、及D-Valine條件培養(yǎng)基純化的SCs的純度5d后達到99.1％。2）得到分辨率和重復性均較好的雙向凝膠電泳圖譜，每組膠的蛋白表達點為3500個上下，平均匹配率分別為98%、95%、97%。3）誘導前的HUCBMSCs與SCs有290個蛋白差異點，誘導后的類SCs與SCs僅有161個差異蛋白點，表明誘導后的HUCBMSCs在蛋白質(zhì)組成方面更加接近SCs。4）對篩選出的41個蛋白匹配點，其中有25個蛋白點差異超過3倍，取這25個蛋白點進

6、行質(zhì)譜分析最終共有20個點被成功鑒定，分別屬于細胞骨架蛋白、細胞調(diào)控蛋白、能量代謝蛋白以及蛋白酶類蛋白，其中包含兩種公認的SCs標記蛋白（S100β及GFAP）。5）在這20個蛋白點中選取3種蛋白進行免疫印跡驗證，驗證結(jié)果基本與雙向電泳及質(zhì)譜鑒定的結(jié)果一致。
　　結(jié)論：
　　1.通過低酶消化、差速貼壁以及 D-Valine條件培養(yǎng)基相結(jié)合純化 SCs的方法培養(yǎng)SCs所需時間較短，純度更高，能夠為下一步的神經(jīng)組織工程提供細胞來

7、源。
　　2. HUCBMSCs誘導后在蛋白質(zhì)構成方面更加接近正常的SCs。
　　3.本實驗成功鑒定出的20個蛋白點，分別屬于細胞骨架蛋白、細胞調(diào)控蛋白、能量代謝蛋白以及蛋白酶類蛋白，這些蛋白的含量變化是由于誘導劑刺激細胞產(chǎn)生的，大多數(shù)對于神經(jīng)的分化與生長起著重要的作用，這其中還包含兩種公認的SCs標記蛋白（S100β及GFAP）。
　　4.這些差異蛋白的尋找對于今后更好的優(yōu)化體外誘導方案以及指導間充質(zhì)干細胞的體外的定