HGF通過MEK-ERK和PI3K-AKT信號途徑影響人大腸癌細胞侵襲能力及VEGF表達.pdf

1、目的： 1.檢測臨床大腸癌患者及正常人HGF及VEGF血清水平，并初步分析其與臨床病理資料相關(guān)性及二者相關(guān)性。 2.觀察HGF對大腸癌細胞Lovo、SW480、Colo205粘附、遷移及侵襲能力的影響。 3.檢測HGF對大腸癌細胞及正常腸上皮細胞VEGF表達的影響。 4.探討MEK/ERK1/2和PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在HGF影響大腸癌細胞侵襲能力及VEGF表達過程中可能的作用。 方法：

2、 1.應(yīng)用ELISA 方法檢測大腸癌患者及正常對照者HGF、VEGF血清學(xué)水平。 2.細胞培養(yǎng)：大腸癌細胞Lovo、SW480、Colo205及正常腸上皮細胞系按常規(guī)方法培養(yǎng)。 3.細胞經(jīng)外源性HGF處理后，應(yīng)用MTT法檢測Lovo、SW480、Colo205及正常腸上皮細胞粘附能力變化，Transwell小室結(jié)合倒置顯微鏡觀察腫瘤細胞遷移能力變化，Transwell小室結(jié)合Matrix膠檢測腫瘤細胞侵襲能力的變化；

3、HGF、c-Met磷酸化抑制劑Herbimycin A(HA)、MEK/ERKl/2信號通路特異性抑制劑UO126、P13K/AKT信號通路特異性抑制劑LY294002分別處理細胞后，檢測細胞侵襲能力變化并應(yīng)用ELISA及RT-PCR方法檢測細胞VEGF表達變化。 4.Westem blot方法檢測HGF、HA、UO126及LY294002處理后細胞VEGF蛋白表達水平的變化，同時檢測c-Met及信號通路相關(guān)信號分子蛋白水平及磷

4、酸化水平的變化。 結(jié)果： 1.大腸癌患者HGF、VEGF血清水平分別是正常人的約2.8倍、2.5倍(P<0.01)，相關(guān)分析顯示大腸癌患者血清HGF水平與臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.01)，而與病理類型和分化程度無相關(guān)性(P>0.05)；VEGF水平與病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型相關(guān)(P<0.05)，而與分化程度無相關(guān)性(P>0.05)；HGF血清水平與VEGF血清水平呈正相關(guān)(r=0.76，P<0.01)。

5、 2.外源性HGF明顯增加大腸癌細胞Lovo、SW480、Colo205粘附比率、遷移及侵襲細胞數(shù)量，40ng的HGF作用4h后，粘附細胞比率較對照組分別增加63.33％、40.63％、39.13％(P<0.05)；24h遷移細胞數(shù)量較對照組分別增加88.05％、124.13％、127.08％(P<0.05)；24h侵襲細胞數(shù)量較對照組分別增加101.27％、89.46％、91.82％(P<0.05)，而正常腸上皮細胞無明顯變化

6、(P>0.05)。c-Met磷酸化抑制劑HA、MEK/RK1/2信號通路特異性抑制劑UO126及P13K/AKT信號通路特異性抑制劑LY294002均顯著抑制由 HGF 誘導(dǎo)的大腸癌細胞粘附、遷移及侵襲能力(P<0.05)。 3.ELISA、R11-PCR結(jié)果顯示：大腸癌細胞有VEGF蛋白及mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達，應(yīng)用10ng、40ng、100ng HGF處理后，VEGF蛋白及mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著增加且與HGF濃度之間存在明顯相

7、關(guān)性，而正常腸上皮細胞無明顯變化。HA、UO126及LY294002均顯著抑制由HGF誘導(dǎo)的大腸癌細胞VEGF表達，HA 1.0μg、UO126合用LY294002 30μM時均幾乎完全抑制HGF誘導(dǎo)的大腸癌細胞VEGF表達。 4.Western blot結(jié)果示：大腸癌細胞c-Met表達，而正常腸上皮細胞未檢測到其表達；外源性HGF誘導(dǎo)大腸癌細胞c-Met、ERK1/2、AKT磷酸化及VEGF蛋白表達，且與HGF劑量有關(guān)。HA降

8、低HGF所引起的c-Met磷酸化水平，1.0μg時完全抑制HGF所誘導(dǎo)的c-Met磷酸化；UO126、LY294002均顯著降低由HGF所誘導(dǎo)的大腸癌細胞ERK1/2、AKT磷酸化水平，且兩者之間無交叉抑制性。 結(jié)論： 1.大腸癌患者HGF、VEGF血清水平高于正常人血清水平，HGF可能與大腸癌局部浸潤、轉(zhuǎn)移及腫瘤細胞VEGF表達有關(guān)。 2.HGF可顯著提高大腸癌細胞的粘附、遷移及侵襲能力，HGF促進腫瘤細胞粘附