天花粉蛋白核糖體活性位點的刪除及其對APC基因甲基化作用的影響.pdf

1、目的:宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中存在DNA甲基化水平和模式的紊亂,DNA甲基化異常可影響癌基因和抑癌基因的表達而參與腫瘤的形成。天花粉蛋白(TCS)具有對多種高甲基化狀態(tài)的抑癌基因啟動子進行去甲基化的作用,并由此上調(diào)這些抑癌基因的表達水平,但是TCS發(fā)揮去甲基化的機制尚未闡明。在前期天然天花粉蛋白(nTCS)能夠抑制宮頸癌細胞增殖和逆轉抑癌基因啟動子甲基化的研究基礎上,本課題重點研究nTCS抗宮頸癌和去甲基化的機制。
　　方法:1.利用

2、重疊延伸PCR得到活性位點突變的天花粉蛋白(mTCS)的目的片段,將其插入到pET-28a(+)空載中,成功構建的表達質(zhì)粒pET-28a(+)-mTCS轉化入E.coli BL21(DE3)細胞,IPTG誘導表達mTCS,用金屬鎳螯合層析法純化mTCS后進行Western-blot鑒定;2.酶活性分析檢測mTCS生物活性,MTT法檢測mTCS和nTCS對宮頸癌 HeLa細胞增殖的影響,流式細胞術檢測mTCS和nTCS對宮頸癌細胞周期的影

3、響;3甲基化特異性PCR(MSP)檢測人宮頸癌Hela細胞中APC基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化狀態(tài),反轉錄PCR(RT-PCR)和半定量PCR法研究mTCS和nTCS對APC基因mRNA表達水平的影響,Western-blot法檢測mTCS和nTCS對APC基因蛋白表達水平的影響。
　　結果:1.IPTG可誘導mTCS在E.coli中表達,溫度較低的培養(yǎng)環(huán)境(30℃)有利于表達;用Ni2+-NTA樹脂親和層析法從誘導表達菌中獲得了

4、較高純度的mTCS;DNA酶活性檢測發(fā)現(xiàn)刪除核糖體活性位點的天花粉蛋白體外切割超螺旋DNA的作用喪失;2.MTT法分析表明在0-100μg/mL的濃度范圍內(nèi),隨著藥物濃度的增加,nTCS對 HeLa細胞的生長抑制率逐漸增大,與對照組相比存在顯著差異(P﹤0.01),不同濃度 mTCS處理對細胞生長沒有明顯的抑制作用;流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)nTCS可以阻滯細胞于 S期,從而抑制宮頸癌細胞生長,mTCS不能發(fā)揮這一作用;3.MSP法檢測發(fā)現(xiàn)宮頸

5、癌HeLa細胞中APC基因為高甲基化狀態(tài),80mg/L nTCS處理48h后,APC基因啟動子區(qū)去甲基化,但是經(jīng)80mg/L mTCS處理后 APC基因高甲基化狀態(tài)沒有改變;RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),在TCS處理前APC基因mRNA水平為低表達,經(jīng)80mg/L的mTCS處理后mRNA表達水平?jīng)]有變化,但經(jīng)80mg/L的nTCS處理后mRNA表達水平顯著升高;Western-blot法檢測Hela細胞APC蛋白水平的變化發(fā)現(xiàn),與對照細胞比較,

6、80mg/L mTCS處理的Hela中APC蛋白含量無顯著變化,但經(jīng)80mg/L nTCS處理的細胞內(nèi)APC蛋白含量顯著增高。
　　結論:本實驗成功地在E.coli中原核表達和純化出mTCS,DNA酶活性檢測發(fā)現(xiàn)刪除核糖體活性位點的天花粉蛋白體外切割超螺旋 DNA的作用喪失,nTCS能夠抑制宮頸癌 HeLa細胞的增殖,并且能夠阻滯 HeLa細胞周期于S期,從而發(fā)揮抗腫瘤藥理作用。純化的mTCS對HeLa細胞的增殖沒有明顯抑制作用。