血管基膜衍生多功能肽抗血管新生活性及信號蛋白磷酸化比較研究.pdf

1、研究背景:重組血管基膜衍生多功能肽(Recombinant Vascular Basement-derived Multifunctional Peptide,rVBMDMP)是通過人工合成人IgG3上游鉸鏈區(qū)序列連接tumstatin74-98氨基酸肽和197-215氨基酸肽序列的融合基因,構(gòu)建原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染入大腸桿菌生產(chǎn)的一種同時具有抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和腫瘤細(xì)胞增殖兩種不同抗腫瘤特性的多肽類抗腫瘤候選藥物。前期研究表明:r

2、VBMDMP(10mg/kg、6mg/kg、2mg/kg)對小鼠Lewis肺癌自發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤模型皮下移植瘤瘤重和肺轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)抑制率均大于50％。本實(shí)驗(yàn)觀察rVBMDMP抑制人臍靜脈內(nèi)皮(HUVEC-12)細(xì)胞系細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡作用;并利用抗體芯片技術(shù)檢測rVBMDMP對HUVEC-12細(xì)胞信號蛋白磷酸化水平的影響,初步探討rVBMDMP抗血管新生作用的分子機(jī)制。
　　方法:采用MTT比色法檢測rVBMDMP對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性

3、的影響,臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計數(shù)法測定其對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響,內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)測定其對血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)形成能力的影響,PI染色流式細(xì)胞分析術(shù)檢測其對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的影響,吖啶橙(AO)染色熒光顯微鏡觀察rVBMDMP作用后細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的改變,劃痕法觀察其對血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響。體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮(HUVEC-12)細(xì)胞,制備全細(xì)胞抽提液,采用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抗體芯片TM(Hypromatrix)檢測rVBMDMP處理HUVE

4、C-12細(xì)胞前后細(xì)胞信號蛋白的酪氨酸(絲氨酸及蘇氨酸)磷酸化水平變化。
　　結(jié)果:MTT比色法、臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計數(shù)法結(jié)果顯示:rVBMDMP顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和生長,呈濃度和時間依賴性,rVBMDMP(1.0μM)作用96h,血管內(nèi)皮細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)僅為溶酶對照組的50%。內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,rVBMDMP顯著降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮管狀結(jié)構(gòu)數(shù)目(17.67±3.055 vs50.33±3.055)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,

5、rVBMDMP處理后血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率呈濃度依賴性增加,其中1.0μM濃度組凋亡率高達(dá)14.41%。吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察rVBMDMP處理后內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)典型凋亡的形態(tài)學(xué)改變。劃痕法顯示rVBMDMP對細(xì)胞遷移能力無明顯影響。
　　抗體芯片檢測結(jié)果顯示,與10%小牛血清刺激增殖的內(nèi)皮細(xì)胞比較,血管基膜衍生多功能肽(1.0μM)處理30分鐘后的血管內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化水平升高的蛋白包括:整合蛋白αv、β1和β3亞單位、生長因子結(jié)合蛋白(

6、Grb2)、細(xì)胞間粘附分子(PECAM-1、ICAM-1)、細(xì)胞凋亡執(zhí)行分子Caspase3、細(xì)胞支架蛋白和緊密連接蛋白(Connexin43、Ezrin、Paxillin、ZO-1、PAR-3)、非受體酪氨酸激酶Axl、Csk和轉(zhuǎn)錄因子ATF-3、p-ATF-3、死亡受體包括DR3、DR4、DR5、受體相互作用蛋白(RIP)、干擾素相關(guān)因子(IRF1,IRF2);磷酸化水平降低的蛋白包括:周期調(diào)控蛋白(Cyclin A、Cyclin

7、B、CyclinE、CDK2)、上皮生長因子受體( EGFR、p-EGFR)、血管內(nèi)皮生長因子受體 VEGFR1、生存素(SURVIVIN)、早期生長反應(yīng)基因Egr-1、信號傳導(dǎo)子激活轉(zhuǎn)錄因子STAT1。
　　結(jié)論:
　　1. rVBMDMP具有抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用。
　　2. rVBMDMP能有效地誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
　　3. rVBMDMP對人血管內(nèi)皮管狀結(jié)構(gòu)形成能力具有抑制作用。
　　4.

8、 rVBMDMP抗新生血管形成作用的可能機(jī)制包括:
　　(1)rVBMDMP通過與整合蛋白αv、β1、β3亞基相互作用,使它們磷酸化程度增強(qiáng),改變它們的構(gòu)象和活性,影響整合蛋白α1β1和αvβ3復(fù)雜的多效信號傳導(dǎo)途徑,發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。
　　(2)rVBMDMP通過整合蛋白信號傳導(dǎo)和受體酪氨酸激酶信號傳導(dǎo)雙向流動模式,降低表皮生長因子受體和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體磷酸化水平和活性,抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)內(nèi)皮