血管基膜衍生多功能肽基因在畢赤酵母中的表達.pdf

1、目的:構(gòu)建血管基膜衍生多功能肽基因的真核表達載體,導(dǎo)入酵母菌GS115并用甲醇誘導(dǎo)表達,獲得血管基膜衍生多功能肽,為深入研究血管基膜衍生多功能肽的作用及機理奠定基礎(chǔ).方法:用PCR技術(shù)獲得帶有SnabI和NotI酶切位點并融合有GST的目的基因片段并進行測序鑒定,將PCR產(chǎn)物純化、酶切、回收,克隆到pPIC9K載體,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a擴增,用瓊脂糖凝膠電泳,限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序鑒定.Bgl Ⅱ線性新構(gòu)建的表達載體pPIC9K

2、-GST-VBMDMP,然后用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母細胞,并用pPIC9K空質(zhì)粒也轉(zhuǎn)入酵母原生質(zhì)體細胞進行對照.用煮-凍-煮法裂解已轉(zhuǎn)化有目的基因的畢赤酵母細胞提取DNA并行PCR鑒定,獲得陽性重組子.行多克隆篩選和表型鑒定.挑選His<'+>Mut<'s>陽性重組子在MGY液體培養(yǎng)基中30℃搖床培養(yǎng),每24h從培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移1ml培養(yǎng)基上清于-70℃保存,并保持培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基的量和培養(yǎng)基中甲醇0.5％的濃度不變,8天后行SDS-PA