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文檔簡介
1、研究背景 鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)又稱“廣東瘤”,是我國常見的惡性腫瘤之一。目前NPC主要的治療手段是放射治療,隨著放射治療技術(shù)的不斷提高和放化療的綜合應(yīng)用,NPC的5年生存率仍徘徊于50﹪~60﹪。由此可見,NPC臨床上需探討新的治療模式以改善其5年生存率。近年來,隨著對NPC等多種腫瘤發(fā)病機制及細胞生長調(diào)控機理研究的深入,研究者提出將基因治療與其它傳統(tǒng)抗癌策略如放射治療、化學(xué)治療、免
2、疫治療等相結(jié)合,希望獲得增強或協(xié)同的抗癌作用,其中自殺基因系統(tǒng)與放射治療聯(lián)合在多種實體瘤的治療上是較有前景的一種方案。但目前的自殺基因系統(tǒng)大多是直接針對腫瘤細胞的治療方式。 已有研究表明VEGF及KDR在NPC組織中高表達,且與NPC腫瘤血管的形成呈正相關(guān)。體內(nèi)、外實驗均已證實KDR啟動子調(diào)控的自殺基因可在NPC血管內(nèi)皮細胞內(nèi)表達并具有靶向殺傷NPC血管的能力。因此,放射聯(lián)合靶向NPC微血管內(nèi)皮細胞自殺基因系統(tǒng)(AdKDR-tk
3、/GCV system)治療能否改善并提高NPC的局控率和生存率值得探討。研究目的將由腺病毒(Adenovirus)載體介導(dǎo)的、KDR基因啟動子調(diào)控的單純皰疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus-thymidine kinase,HSV-tk)表達的自殺基因系統(tǒng)(AdKDR-tk/GCV System)轉(zhuǎn)入荷瘤裸鼠的人NPC移植瘤內(nèi),同時聯(lián)合<'60>Co γ射線腫瘤局部外照射,評價外照射和AdKDR-tk/GCV
4、自殺基因系統(tǒng)對NPC是否具有協(xié)同殺傷作用以及作用的大小,為NPC的臨床治療提供新思路和方法。 材料和方法 1細胞培養(yǎng) 1.1細胞株人鼻咽癌CNE-2細胞株。 1.2實驗材料RPMI 1640培養(yǎng)基、超凈工作臺、78-1型電熱恒溫培養(yǎng)箱等。 1.3實驗方法將CNE-2人鼻咽低分化鱗癌細胞株置于10﹪小牛血清的“RPMI”1640培養(yǎng)基培養(yǎng),并于培養(yǎng)液中加入青霉素100 U/ml,鏈霉素100mg/m
5、l。傳代一周,待細胞長成滿瓶時,用0.25﹪胰蛋白酶和0.02﹪。EDTA(乙二胺四乙酸),按1:1混合配成消化液,制成每毫升含5×10<'6>個細胞懸液。 2重組腺病毒構(gòu)建(由北京大學(xué)深圳醫(yī)院李寶金博士構(gòu)建)2.1實驗材料pBluescript ⅡKDR-tk、穿梭質(zhì)粒ptrack、腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-1及胚胎腎細胞系293細胞等。 2.2實驗方法采用pAdeasy系統(tǒng),按定向克隆方法將KDR-tk片段正向插入表
6、達載體的多克隆位點間,構(gòu)建受KDR啟動子調(diào)控并可表達HSV-tk基因的pAdKDR-tk,在293細胞中包裝、擴增。 3裸鼠鼻咽癌移植瘤模型的建立3.1實驗動物BALB/C近交系裸鼠32只,雌雄各半,4-6周齡,體重15-20克。 3.2實驗材料1ml醫(yī)用注射器和裸鼠飼養(yǎng)房等。 3.3實驗方法將含1×10<'6>個(0.2 ml)CNE-2細胞的懸液注射到裸鼠背側(cè)右后肢上部皮下后,于中山大學(xué)動物實驗中心二級以上動
7、物實驗室飼養(yǎng),并定期觀察記錄移植瘤生長情況。 4動物分組和治療4.1實驗材料重組腺病毒系統(tǒng)(AdKDR-tk system)、丙氧鳥苷(g8nciclovir, GCV)、780C型<'60>Co機等。 4.2實驗方法4.2.1動物分組CNE-2細胞接種結(jié)束后第14天時,全部成瘤,大小約200ram<'3>,將裸鼠隨機分為4組,每組8只,分別為自殺基因聯(lián)合放射治療組(Ⅰ組:AdKDR-tk+GCV+Radiation)、
8、放射治療組(Ⅱ組:Radiation+PBS)、自殺基因治療組 (Ⅲ組:AdKDR-tk+GCV)和空白對照組(Ⅳ組:AdKDR-tk+PBS)。 4.2.2治療分別對Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ組裸鼠瘤體內(nèi)進行多點注射重組腺病毒液共0.2m1,此后24小時和第7天各重復(fù)注射一次重組腺病毒液。第二次注射病毒液時,同時向Ⅰ、Ⅲ組小鼠腹腔注射GCV 100 mg/kg,Ⅱ、Ⅳ組小鼠腹腔注射PBS100mg/kg,每日一次,連續(xù)14天。其中Ⅰ、Ⅱ組小鼠
9、分別于腹腔注射GCV和PBS后12小時以水合氯醛300mg/kg腹腔內(nèi)注射,麻醉后施行<'60>Co γ射線局部外照射裸鼠移植瘤(1 cm寬條形放射野照射瘤體),225倫琴/分鐘,2Gy/次,隔日外照射一次,共7次,外照射總劑量14Gy。 4.2.3動態(tài)觀察記錄裸鼠移植瘤生長大小治療前l(fā)天及治療開始后的第3天,第6天,第9天,第12天,第15天,第18天及第21天測量瘤體垂直長徑和短徑,繪制瘤體生長曲線。 4.2.4處死
10、裸鼠、剝離腫瘤并測量實體瘤質(zhì)量治療結(jié)束后第8天處死裸鼠,剝離瘤塊并稱重,計算各組的腫瘤質(zhì)量抑制率。 4.2.5取材、收集標本腫瘤稱重結(jié)束后將其浸泡于4﹪多聚甲醛中固定,保存標本備用。 5常規(guī)病理學(xué)檢查5.1實驗材料蘇木素、伊紅、乙醇、二甲苯、OLYMPUS光學(xué)顯微鏡、真空干燥箱、組織切片機等。 5.2實驗方法采用切片、脫蠟、蘇木素、伊紅染色及脫水步驟。 6免疫組化染色6.1實驗材料鼠抗人CD34單克隆抗體
11、、B10TINYLATED-GOAl、IgG(H+L)、親合素-過氧化酶復(fù)合物、電子天平、真空干燥箱、微量可調(diào)移液器、微波爐等。 6.2實驗方法6.2.1免疫組化采用ABC法步驟采用切片、脫蠟、抗原修復(fù)、滴加一抗、二抗及親合素-過氧化酶復(fù)合物和復(fù)染蘇木素步驟。 6.2.2免疫組化CD34結(jié)果判定分別于低倍鏡(×40)和高倍鏡(20×10)下按 weidner方法計數(shù)腫瘤微血管密度(Microvessel density,
12、MVD)。 7 統(tǒng)計學(xué)方法實驗結(jié)果采用采用SPSS 11.0統(tǒng)計學(xué)軟件,瘤體體積、質(zhì)量及MVD值均以x±S表示,組問均數(shù)比較采用t檢驗進行分析。 結(jié)果 1 pBluescript Ⅱ KDR-tk鑒定經(jīng)Xho Ⅰ/Sal Ⅰ酶切后,顯示為兩條片段,分別為2.2kb和2.96kb,大小及測序結(jié)果與提供資料相符。 2重組腺病毒質(zhì)粒pAdKDR-tk鑒定重組pAdKDR-tk經(jīng)Pac Ⅰ酶切,顯示的2個片段大小
13、與預(yù)期值(4.5kb和37kb)一致。 3重組腺病毒的產(chǎn)生及滴度測定重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞后,熒光顯微鏡下可見細胞有GFP表達。經(jīng)3次293細胞內(nèi)的擴增、CsCl梯度離心后,測定病毒滴度為1×10<'10>pfu/ml。 4重組腺病毒的鑒定PCR分析外源基因的整合按標準方法抽提病毒基因組DNA,取1 μl進行PCR,結(jié)果表明病毒載體介導(dǎo)tk基因整合至重組腺病毒基因組中。 RT-PCR分析外源基因的表達采用T
14、RIzol試劑盒,抽提293細胞總RNA,進行RT-PCP反應(yīng),可見擴增的片段,表明tk基因在mRNA水平上能有效的表達。 5裸鼠人NPC移植瘤生長曲線癌細胞系接種在BALB/C裸鼠兩周全部成瘤。治療前各組腫瘤體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);經(jīng)治療后第3天起小鼠瘤體體積發(fā)生變化,Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ組裸鼠移植瘤體積小于Ⅳ組裸鼠腫瘤體積,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);第6天前,Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ組問裸鼠腫瘤大小無顯著差異性(P>0.05
15、);從第9天起,Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ組間腫瘤體積大小由大到小依次為Ⅲ組、Ⅱ組和Ⅰ組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 6腫瘤質(zhì)量抑制率結(jié)果顯示Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組的腫瘤質(zhì)量小于Ⅳ組腫瘤質(zhì)量,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),且Ⅰ組的腫瘤質(zhì)量抑制率為84.39﹪,高于Ⅱ、Ⅲ組的70.88﹪和58.43﹪,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),Ⅱ組腫瘤質(zhì)量抑制率高于Ⅲ組,差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),初步實驗證實:綜合治療組明顯優(yōu)于單純放
16、療或自殺基因治療組。 7常規(guī)病理檢查結(jié)果空白對照組癌細胞體積大,呈圓形、卵圓形或不規(guī)則形,胞漿界限不清,細胞呈團塊狀或片巢狀不規(guī)則排列,可見泡狀核,部分細胞見明顯核仁。放射治療聯(lián)合自殺基因治療組NPC細胞數(shù)目較單一放療組、單純自殺基因治療組和空白對照組NPC細胞數(shù)目減少,癌細胞呈退行性變,見大量核碎裂。 8免疫組化CD34微血管計數(shù)結(jié)果CD34.陽性表達呈棕黃色或棕褐色顆粒狀,表達于血管內(nèi)皮細胞膜中。治療結(jié)束后空白對照組及治療組
17、免疫組化染色均可見腫瘤間質(zhì)內(nèi)染成棕褐色單個內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞簇的微血管。 結(jié)論 1.利用腺病毒載體轉(zhuǎn)染HSV-tk基因聯(lián)合放射治療BALB/C近交系荷人NPC裸鼠可明顯抑制瘤體生長,且抑制程度優(yōu)于單一放療或自殺基因治療組(P<0.05),治療后腫瘤質(zhì)量抑制率高于單一放療或自殺基因治療組(P<0.05)。 2.免疫組化CD34微血管計數(shù)顯示聯(lián)合治療組MVD平均值為2.73±0.30,小于單一放療組或自殺基因治療
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