TPEN抑制缺血缺氧和-或高鋅培養(yǎng)PC12細(xì)胞死亡的相關(guān)研究.pdf

1、鋅是維持機(jī)體機(jī)能的重要微量元素之一。作為離子形態(tài)存在于組織中的鋅，不但是很多維持生命活動(dòng)功能物質(zhì)分子如酶的組成部分或輔助因子，也是神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)。已有的研究表明，鋅離子可以參與一系列神經(jīng)活動(dòng)。缺血性腦卒中作為一種常見的神經(jīng)性疾病，鋅離子在其發(fā)生過程中扮演著一個(gè)重要的角色。缺血缺氧狀態(tài)引起的神經(jīng)細(xì)胞逐漸凋亡的過程中，不利的胞外環(huán)境、游離的鋅離子、胞內(nèi)釋放的各種內(nèi)溶物等多種因素的相互影響相互作用，這些因素或許共同促成了缺血缺氧

2、下的神經(jīng)細(xì)胞逐漸失去功能，最終造成死亡。如何有效抑制缺血缺氧致神經(jīng)死亡，對(duì)缺血性腦卒中的防治方案提出具有潛在的價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)以PC12細(xì)胞作為研究對(duì)象，使用化學(xué)方法模擬細(xì)胞的缺血缺氧狀態(tài)，建立PC12細(xì)胞的OGD模型。同時(shí)為了研究鋅離子在缺血缺氧引起細(xì)胞死亡這一過程中所具體產(chǎn)生的影響，采用鋅離子的特異性螯合劑TPEN作為工具藥物。研究了不同濃度鋅離子以及不同濃度的TPEN對(duì)PC12OGD模型細(xì)胞各項(xiàng)生理特性和相關(guān)指標(biāo)的影響，希望明確在離體

3、狀態(tài)下鋅離子與缺血缺氧對(duì)神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)的影響，為缺血缺氧狀態(tài)引起的神經(jīng)損傷機(jī)制的研究提供一些依據(jù)，并對(duì)缺血性腦卒中的防護(hù)治療預(yù)后恢復(fù)等提供一些思路。
　　1.不同鋅離子濃度、TPEN濃度以及不同鋅離子濃度與TPEN濃度聯(lián)合分別處理對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響:在培養(yǎng)的狀態(tài)良好的PC12細(xì)胞中分別加入10，50，100，200μM濃度的鋅離子，24h后觀察細(xì)胞的存活率。結(jié)果，24h后隨著鋅離子濃度的增加，PC12細(xì)胞的存活率不斷降低，當(dāng)

4、鋅離子濃度達(dá)到100μM時(shí)，細(xì)胞的存活率為50％左右，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用這個(gè)濃度鋅離子。在培養(yǎng)狀態(tài)良好的PC12細(xì)胞中分別加入0.1，0.5，1，5，10，50μM TPEN，24h后觀察細(xì)胞的存活率。結(jié)果，24h后，低濃度(0.1，0.5，1μM) TPEN對(duì)細(xì)胞生存無影響，5μM濃度的TPEN開始影響正常培養(yǎng)基培養(yǎng)下細(xì)胞的存活率。在培養(yǎng)狀態(tài)良好的PC12細(xì)胞中先加入100uM鋅離子，再分別加入20，30，40，50，60，70，80，9

5、0μM TPEN，3h與24h后分別觀察細(xì)胞存活率。結(jié)果，3h后，20，30，40，50μM TPEN均表現(xiàn)出一定程度的保護(hù)作用，并逐漸增強(qiáng)，超過50μM后TPEN反而加速了細(xì)胞存活率的降低。24h后，各濃度的TPEN對(duì)鋅離子影響下細(xì)胞的保護(hù)作用均有所下降。由于在50μM濃度下TPEN保護(hù)作用最為明顯，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用此濃度的TPEN作為處理濃度。實(shí)驗(yàn)將PC12細(xì)胞分為對(duì)照（培養(yǎng)狀態(tài)良好的PC12細(xì)胞）、OGD處理、，OGD+TPEN

6、(50μM)、OGD+鋅離子(100μM)，OGD+鋅離子(100μM)+TPEN(50μM)等實(shí)驗(yàn)組，分別處理3h，6h，24h。
　　2.通過TUNEL法檢測(cè)不同處理下PC12細(xì)胞的凋亡情況。不同組細(xì)胞處理后通過TUNEL檢測(cè)試劑盒檢測(cè)凋亡發(fā)生情況并在熒光顯微鏡下拍照記錄對(duì)比。結(jié)果，3h處理對(duì)照組幾乎無凋亡情況，OGD處理發(fā)生少量凋亡，OGD后加入TPEN可以緩解凋亡情況。OGD加入鋅離子后凋亡現(xiàn)象加劇，再加入TPEN后同樣可

7、以緩解。6h，24h處理可以看到同樣的趨勢(shì)，但TPEN的保護(hù)作用逐漸減弱。
　　3.對(duì)不同處理PC12細(xì)胞相關(guān)生理狀態(tài)的檢測(cè):不同組細(xì)胞處理后利用膜片鉗檢測(cè)不同處理對(duì)細(xì)胞鉀通道電流的影響;通過HPLC檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離興奮性氨基酸的含量;通過免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜表面興奮性氨基酸受體AMPAR（GluR2亞基）和NMDAR（NR1亞基）含量的變化。結(jié)果:(1)對(duì)細(xì)胞鉀通道電流的影響:1h處理后，相對(duì)于對(duì)照組，OGD處理處理導(dǎo)致細(xì)胞外向

8、鉀電流增大，加入TPEN后可以抑制這種電流增大的現(xiàn)象。3h處理后細(xì)胞整體電流水平均減小，TPEN則表現(xiàn)其抑制其減小。(2)對(duì)胞內(nèi)游離興奮性氨基酸的影響:。興奮性氨基酸通過DNCB衍生法進(jìn)行測(cè)定。各組細(xì)胞分別處理3h，6h，24h后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。結(jié)果，OGD處理以及OGD加鋅離子處理后的游離天冬氨酸含量較對(duì)照組有所下降，并隨時(shí)間程度加大，加入TPEN后可以減緩這種下降的趨勢(shì)。OGD處理以及OGD加鋅離子處理后的游離谷氨酸含量較對(duì)照組有

9、所下降，并隨時(shí)間程度加大，加入TPEN后可以減緩這種下降的趨勢(shì)。OGD處理以及OGD加鋅離子處理后的游離谷氨酰胺含量較對(duì)照組有所上升，3h處理加入TPEN后可以抑制這種上升趨勢(shì)，但6h，24h處理后加入TPEN變化趨勢(shì)不是很明顯。(3)通過免疫熒光法對(duì)不同組處理PC12細(xì)胞膜表面興奮性氨基酸受體GluR2與NR1含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果:OGD處理以及OGD加鋅離子處理后的GluR2含量較對(duì)照組有所下降，并隨時(shí)間程度加大，加入TPEN后可以減

10、緩這種下降的趨勢(shì)。OGD處理以及OGD加鋅離子處理后的NR1含量較對(duì)照組有所上升，并隨時(shí)間增長而加大，加入TPEN后可以抑制這種上升的趨勢(shì)。
　　上述結(jié)果表明，基于PC12 OGD模型，缺血缺氧將會(huì)導(dǎo)致PC12細(xì)胞的死亡并使細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑。缺血缺氧可導(dǎo)致細(xì)胞一系列的病理生理學(xué)性變化:胞內(nèi)鉀電流的大量外流，興奮性氨基酸的釋放，膜表面興奮性氨基酸受體含量發(fā)生變化等，這一系列的變化或許與缺血缺氧細(xì)胞死亡或凋亡的機(jī)制相關(guān)。而給予OGD模