TPEN抑制缺血缺氧和-或高鋅培養(yǎng)PC12細胞死亡的相關研究.pdf

1、鋅是維持機體機能的重要微量元素之一。作為離子形態(tài)存在于組織中的鋅，不但是很多維持生命活動功能物質(zhì)分子如酶的組成部分或輔助因子，也是神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)。已有的研究表明，鋅離子可以參與一系列神經(jīng)活動。缺血性腦卒中作為一種常見的神經(jīng)性疾病，鋅離子在其發(fā)生過程中扮演著一個重要的角色。缺血缺氧狀態(tài)引起的神經(jīng)細胞逐漸凋亡的過程中，不利的胞外環(huán)境、游離的鋅離子、胞內(nèi)釋放的各種內(nèi)溶物等多種因素的相互影響相互作用，這些因素或許共同促成了缺血缺氧

2、下的神經(jīng)細胞逐漸失去功能，最終造成死亡。如何有效抑制缺血缺氧致神經(jīng)死亡，對缺血性腦卒中的防治方案提出具有潛在的價值。本實驗以PC12細胞作為研究對象，使用化學方法模擬細胞的缺血缺氧狀態(tài)，建立PC12細胞的OGD模型。同時為了研究鋅離子在缺血缺氧引起細胞死亡這一過程中所具體產(chǎn)生的影響，采用鋅離子的特異性螯合劑TPEN作為工具藥物。研究了不同濃度鋅離子以及不同濃度的TPEN對PC12OGD模型細胞各項生理特性和相關指標的影響，希望明確在離體

3、狀態(tài)下鋅離子與缺血缺氧對神經(jīng)細胞活動的影響，為缺血缺氧狀態(tài)引起的神經(jīng)損傷機制的研究提供一些依據(jù)，并對缺血性腦卒中的防護治療預后恢復等提供一些思路。
　　1.不同鋅離子濃度、TPEN濃度以及不同鋅離子濃度與TPEN濃度聯(lián)合分別處理對PC12細胞存活率的影響:在培養(yǎng)的狀態(tài)良好的PC12細胞中分別加入10，50，100，200μM濃度的鋅離子，24h后觀察細胞的存活率。結果，24h后隨著鋅離子濃度的增加，PC12細胞的存活率不斷降低，當

4、鋅離子濃度達到100μM時，細胞的存活率為50％左右，后續(xù)實驗均采用這個濃度鋅離子。在培養(yǎng)狀態(tài)良好的PC12細胞中分別加入0.1，0.5，1，5，10，50μM TPEN，24h后觀察細胞的存活率。結果，24h后，低濃度(0.1，0.5，1μM) TPEN對細胞生存無影響，5μM濃度的TPEN開始影響正常培養(yǎng)基培養(yǎng)下細胞的存活率。在培養(yǎng)狀態(tài)良好的PC12細胞中先加入100uM鋅離子，再分別加入20，30，40，50，60，70，80，9

5、0μM TPEN，3h與24h后分別觀察細胞存活率。結果，3h后，20，30，40，50μM TPEN均表現(xiàn)出一定程度的保護作用，并逐漸增強，超過50μM后TPEN反而加速了細胞存活率的降低。24h后，各濃度的TPEN對鋅離子影響下細胞的保護作用均有所下降。由于在50μM濃度下TPEN保護作用最為明顯，因此后續(xù)實驗中選用此濃度的TPEN作為處理濃度。實驗將PC12細胞分為對照（培養(yǎng)狀態(tài)良好的PC12細胞）、OGD處理、，OGD+TPEN

6、(50μM)、OGD+鋅離子(100μM)，OGD+鋅離子(100μM)+TPEN(50μM)等實驗組，分別處理3h，6h，24h。
　　2.通過TUNEL法檢測不同處理下PC12細胞的凋亡情況。不同組細胞處理后通過TUNEL檢測試劑盒檢測凋亡發(fā)生情況并在熒光顯微鏡下拍照記錄對比。結果，3h處理對照組幾乎無凋亡情況，OGD處理發(fā)生少量凋亡，OGD后加入TPEN可以緩解凋亡情況。OGD加入鋅離子后凋亡現(xiàn)象加劇，再加入TPEN后同樣可

7、以緩解。6h，24h處理可以看到同樣的趨勢，但TPEN的保護作用逐漸減弱。
　　3.對不同處理PC12細胞相關生理狀態(tài)的檢測:不同組細胞處理后利用膜片鉗檢測不同處理對細胞鉀通道電流的影響;通過HPLC檢測細胞內(nèi)游離興奮性氨基酸的含量;通過免疫熒光技術檢測細胞膜表面興奮性氨基酸受體AMPAR（GluR2亞基）和NMDAR（NR1亞基）含量的變化。結果:(1)對細胞鉀通道電流的影響:1h處理后，相對于對照組，OGD處理處理導致細胞外向

8、鉀電流增大，加入TPEN后可以抑制這種電流增大的現(xiàn)象。3h處理后細胞整體電流水平均減小，TPEN則表現(xiàn)其抑制其減小。(2)對胞內(nèi)游離興奮性氨基酸的影響:。興奮性氨基酸通過DNCB衍生法進行測定。各組細胞分別處理3h，6h，24h后進行HPLC檢測。結果，OGD處理以及OGD加鋅離子處理后的游離天冬氨酸含量較對照組有所下降，并隨時間程度加大，加入TPEN后可以減緩這種下降的趨勢。OGD處理以及OGD加鋅離子處理后的游離谷氨酸含量較對照組有

9、所下降，并隨時間程度加大，加入TPEN后可以減緩這種下降的趨勢。OGD處理以及OGD加鋅離子處理后的游離谷氨酰胺含量較對照組有所上升，3h處理加入TPEN后可以抑制這種上升趨勢，但6h，24h處理后加入TPEN變化趨勢不是很明顯。(3)通過免疫熒光法對不同組處理PC12細胞膜表面興奮性氨基酸受體GluR2與NR1含量進行測定。結果:OGD處理以及OGD加鋅離子處理后的GluR2含量較對照組有所下降，并隨時間程度加大，加入TPEN后可以減

10、緩這種下降的趨勢。OGD處理以及OGD加鋅離子處理后的NR1含量較對照組有所上升，并隨時間增長而加大，加入TPEN后可以抑制這種上升的趨勢。
　　上述結果表明，基于PC12 OGD模型，缺血缺氧將會導致PC12細胞的死亡并使細胞進入凋亡途徑。缺血缺氧可導致細胞一系列的病理生理學性變化:胞內(nèi)鉀電流的大量外流，興奮性氨基酸的釋放，膜表面興奮性氨基酸受體含量發(fā)生變化等，這一系列的變化或許與缺血缺氧細胞死亡或凋亡的機制相關。而給予OGD模