人腎癌786-O細(xì)胞株侵襲力和遷移力的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：腎癌是泌尿道最常見的惡性腫瘤之一,其向周圍以及遠(yuǎn)隔器官侵襲轉(zhuǎn)移是腎癌患者死亡的主要原因,目前腎癌向區(qū)域及臟器轉(zhuǎn)移機(jī)制仍然不明。對腎癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的深層認(rèn)識,從基因/分子水平找突破口是解決問題的一條途徑。PRL屬于一類新的PTP,PRL-3是PRL家族的一個成員。文獻(xiàn)報道,PRL-3高表達(dá)與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)。而PRL-3高表達(dá)在腎癌領(lǐng)域尚無相關(guān)性報道。本課題的目的在于,構(gòu)建攜帶有PRL-3特異miRNA的慢病毒載體,在腎癌細(xì)胞株上觀察

2、其沉默腎癌PRL-3基因后對腎癌細(xì)胞侵襲力與遷移力的影響,以此評價PRL-3基因在腎癌轉(zhuǎn)移中的作用,從而為腎癌轉(zhuǎn)移的后續(xù)治療打下基礎(chǔ)。 方法：利用Invitrogen公司miRNA網(wǎng)上設(shè)計工具,設(shè)計并合成3條PRL-3特異pre-miRNA-A,-B,-C;分別構(gòu)建pcDNA.rPRL-3-miR-A,-B,-C表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染人腎癌786-O細(xì)胞,RT-PCR和Western Blot檢測沉默PRL-3基因效果；選擇pcDNA.

3、rPRL-3-miR-C質(zhì)粒,經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)BP反應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)LR反應(yīng)構(gòu)建重組質(zhì)粒pLenti6/V5.rPRL-3miR-C,-neg(空載體);然后該重組質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒ViraPowerTMPackaging Mix按比例共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞包裝重組慢病毒Lenti.rPRL3-miR-C,-neg(空載體)。以10倍為梯度用重組慢病毒感染786-O細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測病毒滴度。Blasticidin篩選感染重組慢病毒的786-0細(xì)胞,牙科探針

4、在熒光顯微鏡下挑選熒光強(qiáng)度最高的細(xì)胞克??；RT-PCR和Western Blot法檢測沉默PRL-3基因效果。 將細(xì)胞分成3組：786-O(對照)組,Lenti.rPRL3-miR-C組和Lenti.rPRL3-miR-neg(空載體)組,每組8個復(fù)孔,分別培養(yǎng)于12孔板中,當(dāng)細(xì)胞生長到融合度為95％時,以1 mL槍頭作劃痕試驗(yàn),24小時后計算各組遷移到劃痕區(qū)域的細(xì)胞數(shù)。將各組細(xì)胞在無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,各組

5、細(xì)胞在Transwell板上各取6個復(fù)孔,下室中加入完整培養(yǎng)基500μL,上室中加入含有1×105個細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基100μL,24小時后用棉簽去掉隔膜上表面的細(xì)胞,然后固定、復(fù)染,在100倍顯微鏡下挑5個不同視野計數(shù)隔膜下表面的細(xì)胞,計算細(xì)胞侵襲力。 結(jié)果：將pre-miRNA-A,-B,-C連接到表達(dá)質(zhì)粒上即可得到重組質(zhì)粒pcDNA.rPRL3-miR-A,-B,-C,測序表明,3個重組質(zhì)粒的堿基序列均正確；RT-PCR和

6、Western Blot結(jié)果顯示pcDNA.rPRL3-miR-C質(zhì)粒的沉默效果最顯著。該質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒進(jìn)一步經(jīng)BP和LR反應(yīng)重組得到質(zhì)粒pLenti6/V5.rPRL3-miR-C,-neg,測序表明,兩個質(zhì)粒的堿基序列都正確。將病毒上清加入786-O細(xì)胞后12小時后即可觀察到綠色熒光產(chǎn)生證明慢病毒被成功包裝；流式細(xì)胞儀檢測得到濃縮后的重組慢病毒Lenti.rPRL3-miR-C滴度為2×106 TU/mL,空載體重組慢病毒Lent

7、i.rPRL3-miR-neg的滴度為2.5×106 TU/mL。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,侵過基質(zhì)膠膜的細(xì)胞均數(shù)為：786-O組為109±23/HP;Lenti.rPRL3-miR-neg組為112±15/HP;Lenti.rPRL3-miR-C組為32±10/HP。統(tǒng)計分析表明：Lenti.rPRL3-miR-C組侵過基質(zhì)膠膜細(xì)胞數(shù)明顯少于其他兩組(P＜0.05)。遷移力實(shí)驗(yàn)表明：786-O組的平均遷移能力為23±2.6 cells/mm2

8、;Lenti.rPRL3-miR-neg組為20.8±1.9 cells/mm2;Lenti.rPRL3-miR-C組為5±1.6 cells/mm2。統(tǒng)計分析表明：相同面積下Lenti.rPRL3-miR-C組遷移到劃痕中的細(xì)胞數(shù)明顯少于其他兩組(P<0.05)。 結(jié)論：人工設(shè)計的microRNA對目標(biāo)基因具有更好的沉默效率,可滿足基因功能的研究：重組慢病毒載體可為長時間的動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供一個很好的解決方案；沉默PRL-3基因