經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子-α刺激的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性放射性腸損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　第一部分:SD大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)、純化及其生物學(xué)特性鑒定的研究
　　目的:體外分離、培養(yǎng)、純化及鑒定SD大鼠BMSCs,以獲得純度高、生物學(xué)特征穩(wěn)定的BMSCs,為課題研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.運(yùn)用密度梯度離心法聯(lián)合細(xì)胞貼壁法從雄性SD大鼠股骨及脛骨中分離、培養(yǎng)和純化BMSCs,并觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　2.流式細(xì)胞儀檢測CD34、CD44和CD90的表達(dá)。
　　

2、3.用馮庫薩染色法(VonKossa)染色法、油紅O染色鑒定BMSCs向成骨、成脂肪細(xì)胞分化潛能。
　　結(jié)果:
　　1.運(yùn)用密度梯度離心法聯(lián)合細(xì)胞貼壁法分離培養(yǎng)的BMSCs呈克隆式生長,梭形,大小均一。P3代BMSCs純度達(dá)98.5％以上。
　　2.培養(yǎng)的BMSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)CD44、CD90表面抗原,不表達(dá)CD34表面抗原。
　　3.培養(yǎng)的BMSCs經(jīng)成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后可向成骨細(xì)胞及成脂肪細(xì)胞分化。

3、
　　結(jié)論:密度梯度離心法聯(lián)合細(xì)胞貼壁法能成功分離培養(yǎng)出SD大鼠BMSCs。且形態(tài)均一、增殖能力強(qiáng)、純度高、生物學(xué)特征穩(wěn)定,可用于本課題對BMSCs的實(shí)驗(yàn)研究。
　　第二部分:TGF-α誘導(dǎo)BMSCs向上皮細(xì)胞分化的研究
　　目的:探究經(jīng)TGF-α誘導(dǎo)的BMSCs向上皮細(xì)胞的分化能力及最適誘導(dǎo)濃度,為下一步經(jīng)TGF-α刺激的BMSCs對放射性腸道損傷的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:將培養(yǎng)在3板12孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中的

4、BMSCs每板隨機(jī)分為四組,A組:空白對照組。B組:加入200ng/mlTGF-α。C組:加入250ng/mlTGF-α。D組:加入300ng/mlTGF-α。用ELISA檢測第1、3、7天各組細(xì)胞培養(yǎng)液的VEGF濃度,用免疫熒光法檢測第1、3、7天BMSCs中CK蛋白。
　　結(jié)果:1、四組培養(yǎng)液中均檢測到VEGF,同期下C組濃度最高,P〈0.05。
　　2、經(jīng)TGF-α刺激的BMSCs在培養(yǎng)7天后能檢測CK蛋白,同期下C組

5、陽性率最高,P〈0.05。
　　結(jié)論:1、BMSCs在培養(yǎng)中能分泌VEGF
　　2、TGF-α能促進(jìn)BMSCs分泌VEGF,在250ng/ml刺激下分泌較多
　　3、TGF-α能誘導(dǎo)BMSCs向上皮細(xì)胞分化,且250ng/ml的濃度誘導(dǎo)分化最明顯。
　　第三部分:經(jīng)TGF-α刺激的BMSCs干細(xì)胞對急性放射性腸道損傷的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:1、建立急性放射性腸損傷大鼠模型;2、觀察大鼠BMSCs及經(jīng)TGF-α

6、刺激的BMSCs對急性放射性腸道損傷的治療療效,并初步探討療效機(jī)制。
　　方法:
　　1.急性放射性腸損傷大鼠模型的建立:SD大鼠在我院放療科用直線加速器進(jìn)行X線照射?？倓┝?2Gy。
　　2.造模后的180只雌性SD大鼠隨機(jī)分為3組(各60只),即A組(空白對照組)、B組(BMSCs治療組)與C組(經(jīng)TGF-α刺激的BMSCs治療組)。A組于照射后4小時(shí)內(nèi)尾靜脈輸注1ml的生理鹽水;B組于照射后4小時(shí)內(nèi)尾靜脈輸注1×

7、106/ml的SD大鼠BMSCs懸液1ml;C組于照射后4小時(shí)內(nèi)尾靜脈輸注1×106/ml的經(jīng)250ng/mlTGF-α刺激的SD大鼠BMSCs懸液1ml。照射后第1天、3天、7天、14天、21天每組隨機(jī)處死6只大鼠,留取全血與兩份末端回腸標(biāo)本。光鏡下觀察腸道組織結(jié)構(gòu),觀察絨毛高度及隱窩深度;用ELISA方法檢測血清及回腸組織中瓜氨酸及IL-6、TNF-α、VEGF的濃度。
　　結(jié)果:
　　1.SD大鼠急性放射性腸損傷模型建

8、立:成功的建立了SD大鼠急性放射性腸損傷模型。
　　2.BMSCs及經(jīng)TGF-α刺激的BMSCs對急性放射性腸道損傷治療效果:
　　(1):與同時(shí)期A組相比較,B、C組SD大鼠回腸粘膜上皮細(xì)胞壞死和炎性細(xì)胞浸潤少,絨毛及腺體數(shù)量較多;絨毛高度及隱窩深度C﹥B﹥A,P﹤0.05。
　　(2):與同時(shí)期A組相比較,B、C組IL-6、TNF-α在第3、7、14天濃度低,P﹤0.05,且C組濃度低于B組,P﹤0.05,第1天、

9、21天無明顯差異,P﹥0.05。
　　(3):與同時(shí)期A組相比較,B、C組VEGF、瓜氨酸在第3、7、14天濃度低,P﹤0.05。且C組濃度高于B組,P﹤0.05,第1天、21天無明顯差異,P﹥0.05。
　　(4):組織瓜氨酸及IL-6、TNF-α及VEGF濃度均高于同時(shí)期血清濃度。
　　結(jié)論:
　　1.用直線加速器在總劑量12Gy下能成功建立急性放射性腸損傷動(dòng)物模型。
　　2.BMSCs及經(jīng)TGF-α刺