骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)治療擠壓傷性急性腎損傷(衰竭)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 （1）采用密度梯度與貼壁相結(jié)合方法，培養(yǎng)符合實(shí)驗(yàn)要求的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs), 并對其進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定。（2）探索合適、穩(wěn)定的擠壓傷性急性腎損傷(衰竭)制模方法。（3）對出現(xiàn)擠壓傷性急性腎損傷(衰竭)的家兔行BMSCs靜脈移植治療，觀察BMSCs對腎臟修復(fù)的促進(jìn)作用。
　　 方法：
　　 一、兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的分離、培養(yǎng)及鑒定實(shí)驗(yàn)
　　 1.無菌條件下，采取日本

2、大耳白兔股骨及脛骨骨髓，采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)篩選法分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，放置37OC、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代、傳代培養(yǎng)。
　　 2.采用慢速凍存法保存生長良好的P3代BMSCs，并對凍存P3代BMSCs進(jìn)行復(fù)蘇，觀察細(xì)胞的生長狀況。
　　 3.選取生長良好的P1、P3、P5代BMSCs按四唑鹽(MTT)比色法測定不同天數(shù)BMSCs的光吸收值（OD值）。以時間為橫軸，OD值為縱軸，繪制出BMSCs生長曲線

3、。
　　 4.選取生長良好的P3代BMSCs在成脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定時換液，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。兩周后進(jìn)行油紅O染色、拍照。
　　 5.選取生長良好的P3代BMSCs在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定時換液，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。三周后行VonKossa法染色、拍照。
　　 6.選取生長良好的P3代BMSCs加入抗CD29，CD34，CD90抗兔抗體，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原CD29、CD34、CD90的表達(dá)。
　　

4、 二、擠壓傷性急性腎損傷（衰竭）制模實(shí)驗(yàn)
　　 選用日本大耳白兔58只，體重2.7～3.2kg，隨機(jī)分成三組。A組6只，給予27.5kg重量擠壓5小時；B組10只，給予30kg重量擠壓5小時；C組42只，分兩次擠壓，第一次予30kg重量擠壓3小時，24小時后再予30kg重量擠壓3小時。擠壓前及擠壓后7天檢測血肌酐（SCr）、尿素氮值（BUN），擠壓前及擠壓后1天檢測血肌酸激酶（CK）。以血肌酐濃度（SCr）﹥177umol/L為

5、腎功能衰竭的標(biāo)準(zhǔn)，比較各組家兔出現(xiàn)急性腎功能衰竭機(jī)率及生存情況。
　　 三、兔BMSCs治療擠壓傷性急性腎損傷（衰竭）實(shí)驗(yàn)
　　 選取體重2.7～3.2kg的家兔，予30kg重量擠壓3小時，24小時后再予30kg擠壓3小時。挑出制模成功的家兔35只。隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組：耳緣靜脈輸注BMSCs細(xì)胞懸液10ml（1×106/ml）（n=20）；對照組：耳緣靜脈輸注PBS10ml（n=15）。分別于注射BMSCs細(xì)胞懸液或P

6、BS結(jié)束后1d、2d、4d、7d、14d、28d抽取家兔耳朵中央動脈血1.5ml，檢測血肌酐和尿素氮值。每次抽取血液結(jié)束后，隨機(jī)從實(shí)驗(yàn)組及對照組各取一只家兔，空氣注射處死獲取腎臟標(biāo)本，常規(guī)病理切片，HE染色觀察組織學(xué)變化。
　　 結(jié)果：
　　 一、兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的分離、培養(yǎng)及鑒定實(shí)驗(yàn)
　　 原代細(xì)胞呈圓形。貼壁后，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣，以集落的形式生長。傳代后細(xì)胞增殖速度變快，約4～6d就可以長滿

7、瓶底。在相應(yīng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)下，可分化為成脂和成骨等細(xì)胞，表達(dá)CD29，CD34，CD90等抗原，符合BMSCs的特性。其中，P3代細(xì)胞增殖最為活躍。凍存的BMSCs復(fù)蘇后，生長良好。
　　 二、擠壓傷性急性腎損傷（衰竭）制模實(shí)驗(yàn)
　　 A組：2只家兔出現(xiàn)腎功能衰竭；B組：5只出現(xiàn)腎功能衰竭，5只家兔在血肌酐水平尚未達(dá)到腎功能衰竭水平即死亡；C組：35只出現(xiàn)腎功能衰竭，7只家兔在血肌酐水平尚未達(dá)到腎功能衰竭水平即死亡。三組家兔

8、擠壓后均血肌酸激酶（CK）水平顯著升高。
　　 三、兔BMSCs治療擠壓傷性急性腎損傷（衰竭）實(shí)驗(yàn)
　　 1.血肌酐、尿素氮：腎衰后1、2天實(shí)驗(yàn)組與對照組血肌酐、尿素氮值無明顯差異；4、7、14天實(shí)驗(yàn)組血肌酐值分別為208.00±9.46umol/L、155.12±16.13umol/L、98.38±9.51umol/L，與對照組（分別為222.69±18.52umol/L、173.50±13.69umol/L、110.

9、45±14.71umol/L）相比明顯降低（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組血尿素氮值分別為18.30±3.59mmol/L、8.00±1.46mmol/L、6.48±0.63mmol/L，與對照組（分別為24.93±6.50mmol/L、15.36±3.31mmol/L、7.19±0.70mmol/L）相比明顯降低（P<0.05）。
　　 2.腎臟組織形態(tài)變化：擠壓后1、2天實(shí)驗(yàn)組與對照組腎臟組織形態(tài)改變相近；4天腎臟損傷達(dá)到頂峰，但實(shí)

10、驗(yàn)組比對照組略輕；7、14天實(shí)驗(yàn)組腎損傷修復(fù)速度快于對照組。
　　 結(jié)論：
　　 1、采用密度梯度分離法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合，可培養(yǎng)出較高純度、功能良好的日本大耳白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）；
　　 2、間隔24小時，分兩次給予30kg重量擠壓家兔3小時，能誘導(dǎo)出較為穩(wěn)定的急性腎功能損傷（衰竭）模型；
　　 3、靜脈輸注BMSCs能減輕擠壓傷所致的急性腎功能損傷（衰竭）程度，可促進(jìn)腎臟功能和組織