水稻齒葉矮縮病毒基因組S8和S10片段的原核表達(dá)及抗血清制備.pdf

1、水稻齒葉矮縮病毒(RRSV)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)水稻病毒屬(Oryzavirus)的典型成員，。RRSV基因組包括10條雙鏈RNA片段(S1-S10)，本文報(bào)道了福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所分離純化并經(jīng)室內(nèi)保存20多年的RRSV福建沙縣分離株(RRSV-F)的基因組S8和S10片段的編碼區(qū)克隆、原核表達(dá)、Pns10融合蛋白抗血清的制備和P8蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果。　　通過(guò)有機(jī)試劑抽提，CF-11纖維素柱層析，從感病水稻

2、葉片中獲取該病毒的全基因組，根據(jù)RRSV泰國(guó)分離株(RRSV-T)S10開(kāi)放閱讀框(ORF)核苷酸序列(nt142-1035)和S8開(kāi)放閱讀框核苷酸序列(nt23-1810)分別設(shè)計(jì)引物，通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增出特異性目的條帶。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌克隆至pMD18-T載體上，經(jīng)藍(lán)白斑和氨芐青霉素抗性篩選和雙酶切和PCR法鑒定，分別獲得了重組質(zhì)粒pMD18-TS10和pMD18-TS8，并進(jìn)行了序列測(cè)定和分析

3、。　　本文利用DirectionalTOPO克隆技術(shù)將平整末端單向克隆的S10和S8基因分別轉(zhuǎn)入pET100/D-TOPO載體，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并在BL21star(DE3)E.coli中得到了高效表達(dá)，分別獲得了約35kD的Pns10融合蛋白和70kD的P8融合蛋白。將獲得的Pns10融合蛋白免疫大耳白兔制備了抗血清，間接ELISA法測(cè)定抗血清效價(jià)為1：7680，效價(jià)高，Westernblot鑒定表明抗血清特異性強(qiáng)。表達(dá)產(chǎn)物及多