膜型、可溶性Tim-3在抗腫瘤免疫應(yīng)答中的作用及腫瘤基因治療的研究.pdf

1、Tim-3(T-cellimmunoglobulin-andmucin-domain-containgmolecule)分子的發(fā)現(xiàn)是源于尋找區(qū)分TH1細(xì)胞和TH2細(xì)胞的表面標(biāo)志物。對其功能的研究揭示Tim-3在自身免疫性疾病和器官移植排斥反應(yīng)性疾病中具有重要的免疫學(xué)作用。應(yīng)用Tim-3的抗體和Tim-3-Ig融合蛋白能夠影響免疫反應(yīng)，加速疾病的發(fā)展。隨后的研究發(fā)現(xiàn)編碼Tim-3分子的基因通過選擇性剪切產(chǎn)生一長一短兩種形式的mRNA剪切體

2、。長的mRNA指導(dǎo)生成膜型Tim-3(簡稱Tim-3)，膜型Tim-3由信號肽、IgV區(qū)和黏液區(qū)、跨膜區(qū)以及胞質(zhì)區(qū)組成;短的mRNA指導(dǎo)生成包含信號肽、IgV區(qū)和胞質(zhì)區(qū)的蛋白質(zhì)，由于缺少黏液區(qū)，因此推測短的mRNA編碼生成的蛋白質(zhì)可能是可溶性的分子(sTim-3，solubleTim-3)，但是目前缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證實(shí)sTim-3蛋白分子的存在。 許多重要的膜型免疫調(diào)控分子如CD86、Fas、CTLA-4都有天然的可溶性的對照

3、物。而且這些可溶性的對照物在免疫應(yīng)答反應(yīng)中也發(fā)揮重要的作用。Tim-3兩種形式的mRNA剪切體的發(fā)現(xiàn)向我們提出以下幾個方面的問題：(1)在免疫反應(yīng)中Tim-3和sTim-3mRNA的表達(dá)規(guī)律。(2)短的Tim-3mRNA的是否指導(dǎo)生成sTim-3，sTim-3是否具有生物活性。(3)sTim-3和Tim-3在腫瘤免疫應(yīng)答中的作用及可能的作用機(jī)制。 本研究的第一部分和第二部分試圖回答以上幾個方面的問題。 本論文的第三部分的

4、內(nèi)容是有關(guān)克服腫瘤免疫逃避基因治療的研究。目前，以提高機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)為主的治療措施受到廣泛的關(guān)注。但是，近年研究發(fā)現(xiàn)：受到免疫攻擊的腫瘤細(xì)胞會迅速上調(diào)表達(dá)免疫負(fù)性共刺激分子-B7-H1(又被稱為PD-L1)。B7-H1能夠同表達(dá)在活化的T淋巴細(xì)胞表面的免疫抑制性受體PD-1(programdeath-1)結(jié)合進(jìn)而抑制T淋巴細(xì)胞的殺傷作用。因此，腫瘤細(xì)胞表達(dá)B7-H1能夠促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。我們采用本研究小組構(gòu)建的可溶性的PD-1(s

5、PD-1，solublePD-1，)封閉瘤細(xì)胞表面的B7-H1，聯(lián)合HSP70-腫瘤抗原肽復(fù)合物能有效抑制肺部轉(zhuǎn)移性腫瘤。我們還探討了聯(lián)合應(yīng)用的可能作用機(jī)制，希望能為制定有效的腫瘤免疫治療方案提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分 異位表達(dá)Tim-3促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng) 目的：在腫瘤局部組織微環(huán)境中轉(zhuǎn)染表達(dá)Tim-3，并研究Tim-3在調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞功能活性及抗腫瘤方面的作用和機(jī)制。方法：提取鼠脾臟總RNA，RT-P

6、CR擴(kuò)增出Tim-3編碼序列，限制性內(nèi)切酶消化，回收目的片斷并插入到pcDNA3.1相應(yīng)多克隆位點(diǎn)上。構(gòu)建含有Tim-3全長cDNA序列的真核表達(dá)質(zhì)粒，脂質(zhì)體介導(dǎo)體外轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，G418篩選出陽性克隆，流式細(xì)胞儀分析Tim-3的表達(dá)。建立小鼠H22肝細(xì)胞癌移植瘤模型，腫瘤組織內(nèi)注射pTim-3真核表達(dá)質(zhì)粒，RT-PCR、免疫組織化學(xué)法檢測在腫瘤細(xì)胞內(nèi)Tim-3表達(dá)情況。并觀察腫瘤的生長速度和荷瘤鼠的生存期。另外，利用H&E染色法分析

7、瘤組織中淋巴細(xì)胞浸潤情況。分離脾細(xì)胞體外測淋巴細(xì)胞的殺傷作用。流式細(xì)胞儀檢測分析Tim-3在新鮮分離的CD3+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞和接受HSP70-腫瘤抗原肽刺激的CD3+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞表面的表達(dá)情況。結(jié)果：限制性酶切分析及序列測定證實(shí)成功構(gòu)建了小鼠Tim-3真核表達(dá)質(zhì)粒pTim-3。FACS檢測分析顯示轉(zhuǎn)染pTim-3質(zhì)粒的CHO細(xì)胞在表面表達(dá)Tim-3抗原。RT-PCR、免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤接種部位能夠表達(dá)Tim-3mR

8、NA和Tim-3抗原。同生理鹽水對照組和空載體對照組相比，腫瘤接種部位轉(zhuǎn)染表達(dá)Tim-3，能顯著抑制腫瘤生長速率并明顯延長荷瘤鼠的生存期。H&E染色顯示有大量的淋巴細(xì)胞浸潤。接受pTim-3治療的小鼠的脾細(xì)胞殺傷活性明顯增強(qiáng)。流式細(xì)胞儀檢測分析顯示新鮮分離的CD3+T和CD8+T細(xì)胞幾乎不表達(dá)Tim-3。然而，接受腫瘤抗原肽刺激的CD3+T和CD8+T細(xì)胞表面表達(dá)Tim-3。而且隨著刺激次數(shù)的增加，CD3+T和CD8+T細(xì)胞上調(diào)表達(dá)Ti

9、m-3。結(jié)論：在腫瘤微環(huán)境中轉(zhuǎn)染表達(dá)Tim-3，能夠有效地促進(jìn)淋巴細(xì)胞的抗腫瘤活性。Tim-3除去表達(dá)在活化的CD4+T細(xì)胞表面，也可以表達(dá)在活化的CD8+T表面細(xì)胞。 第二部分 可溶性Tim-3抑制T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng) 首先，我們闡明了Tim-3mRNA表達(dá)在骨髓細(xì)胞，胸腺細(xì)胞和脾細(xì)胞中，而sTim-3mRNA僅表達(dá)在脾細(xì)胞中，而骨髓細(xì)胞，胸腺細(xì)胞和其它非免疫組織細(xì)胞不表達(dá)sTim-3mRNA。我們采用Re

10、al-TimePCR的方法研究新鮮分離的脾細(xì)胞和接受刺激的脾細(xì)胞表達(dá)兩型Tim-3mRNA的表達(dá)情況。Real-TimePCR的結(jié)果顯示新鮮分離的脾細(xì)胞主要表達(dá)Tim-3mRNA，而接受刺激的脾細(xì)胞主要表達(dá)sTim-3mRNA。提示Tim-3和sTim-3mRNA的表達(dá)與脾細(xì)胞的免疫狀態(tài)有關(guān)。 然后，我們用Westernblot的方法證實(shí)sTim-3蛋白質(zhì)分子存在于接受刺激的脾細(xì)胞的分泌液中。并且轉(zhuǎn)染了sTim-3真核表達(dá)質(zhì)粒的

11、CHO細(xì)胞分泌液中也存在sTim-3蛋白質(zhì)分子。熒光檢測顯示轉(zhuǎn)染Tim-3-GFP真核表達(dá)質(zhì)粒的CHO細(xì)胞顯示綠色熒光。而轉(zhuǎn)染sTim-3-GFP真核表達(dá)質(zhì)粒的CHO細(xì)胞幾乎不顯示綠色熒光。間接提示sTim-3-GFP以可溶性蛋白的形式被分泌到細(xì)胞外。用轉(zhuǎn)染sTim-3-GFP真核表達(dá)質(zhì)粒的CHO細(xì)胞的上清液同T細(xì)胞共孵育。FACS檢測顯示T細(xì)胞表面的熒光強(qiáng)度明顯高于對照組。證實(shí)sTim-3能夠和T細(xì)胞表面的配體結(jié)合。 體外的實(shí)

12、驗(yàn)結(jié)果顯示sTim-3能夠抑制anti-CD3和anti-CD28的刺激淋巴細(xì)胞增殖激作用。并且sTim-3同樣能夠抑制HSP70-腫瘤抗原肽復(fù)合物的特異性抗原刺激作用。應(yīng)用Tim-3的抗體后能夠阻斷sTim-3抑制淋巴細(xì)胞增殖激作用。ELISA檢測細(xì)胞因子的結(jié)果顯示：sTim-3能明顯抑制IL-2、IFN-γ的分泌，但不影響IL-4的分泌。我們進(jìn)一步采用腫瘤排斥模型研究sTim-3在體內(nèi)的免疫學(xué)活性。結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞在接受sTim-

13、3治療的小鼠體內(nèi)生長更快一些，荷瘤鼠的存活期明顯縮短。和對照組比，接受sTim-3治療的小鼠的脾細(xì)胞增殖能力和殺傷活性明顯降低。病理和免疫組化檢測結(jié)果顯示接受sTim-3治療的瘤組織內(nèi)浸潤T淋巴細(xì)胞的數(shù)目明顯低于對照組。證實(shí)sTim-3在體內(nèi)抑制T細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)。 我們的研究還試圖理解sTim-3影響T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的作用機(jī)制。因?yàn)镃D4+CD25-T效應(yīng)細(xì)胞和CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞都表達(dá)Tim-3的配體。因此

14、，sTim-3抑制T細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)可能是通過抑制CD4+CD25-T效應(yīng)細(xì)胞的活化，或者促進(jìn)CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞的活化。為了回答這個問題。我們采用Real-TimePCR的方法研究反應(yīng)CD4+CD25-T效應(yīng)細(xì)胞和CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞活性狀態(tài)的免疫分子表達(dá)情況。結(jié)果顯示，sTim-3能夠抑制與CD4+CD25-T效應(yīng)細(xì)胞功能相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)，比如IL-2、IFN-γ、TNF-β。但不影響與CD4+CD25+