脫細(xì)胞羊膜與小腸黏膜下層促進(jìn)大鼠皮膚缺損修復(fù)和血管形成.pdf

1、目的: 皮膚具有重要的物理、化學(xué)及生物學(xué)屏障功能，皮膚創(chuàng)傷所引起的局部或全身?yè)p害均與皮膚屏障的喪失有關(guān)，盡早修復(fù)缺損皮膚并最大可能恢復(fù)功能與外觀已成為治療重要目標(biāo)。傳統(tǒng)修復(fù)方法有：自體植皮、同種異體植皮、異種植皮和人工合成皮膚產(chǎn)品的應(yīng)用。但由于供區(qū)不足、免疫排斥及傳播疾病等缺點(diǎn)，使其應(yīng)用受到限制，尋找一種理想的皮膚替代物一直是臨床上一個(gè)亟待解決的難題。組織工程學(xué)技術(shù)在天然或生物合成材料上接種皮膚干細(xì)胞，在生物支架逐步降解吸收的過(guò)

2、程中，種植的細(xì)胞繼續(xù)增生繁殖，形成新的組織工程化皮膚，達(dá)到修復(fù)創(chuàng)傷和重建自身組織功能的目的。因此，“組織工程”的提出為人工構(gòu)建皮膚替代物提供了嶄新且富有挑戰(zhàn)性的新方法。在皮膚組織工程中，生物支架材料一直是其研究的熱點(diǎn)，其產(chǎn)品血管化成為其發(fā)展的瓶頸問(wèn)題。而近年來(lái)研究表明脫細(xì)胞小腸黏膜下層(small intestinal submucosa，SIS)和脫細(xì)胞羊膜(acellular human amniotic membrane，HAM)

3、是兩種很好的生物支架材料，它們?cè)谄渌捌谂R床的實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了很好的生物相容性，促近傷口愈合，更重要的是對(duì)各種損傷組織再生有特異的重塑性。有研究表明這兩種生物支架材料對(duì)皮膚的創(chuàng)傷愈合有相似的修復(fù)效果，這兩種支架材料區(qū)別在于脫細(xì)胞羊膜具有天然的基底膜?；啄ぶ饕散粜湍z原、Ⅶ型膠原和層粘連蛋白組成。層粘連蛋白LN，是由不同的蛋白質(zhì)分子組成的一個(gè)蛋白質(zhì)家族，是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中的非膠原糖蛋白。由Timpl等于1979年首次從鼠ESH肉瘤中

4、發(fā)現(xiàn)并命名。它廣泛分布于基底膜的透明層，緊貼細(xì)胞基底部，與Ⅳ型膠原結(jié)合形成基底膜的骨架，影響細(xì)胞的黏附、運(yùn)動(dòng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。羊膜基底膜厚而連續(xù)，LN作為羊膜基底膜特異和主要的蛋白組成成分，具有與Ⅳ型膠原、硫酸乙酰肝素等分子結(jié)合的部位，同時(shí)還可與上皮細(xì)胞結(jié)合，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)它們黏附在Ⅳ型膠原上并鋪展開，從而促進(jìn)細(xì)胞移行與增殖。 本研究將脫細(xì)胞羊膜、脫細(xì)胞小腸黏膜下層覆蓋于SD大鼠創(chuàng)傷性皮膚缺損上，觀察它們對(duì)創(chuàng)面

5、愈合的作用，同時(shí)在基因表達(dá)水平上檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)情況，觀察它們對(duì)創(chuàng)傷皮膚血管形成的影響，擬找到一種對(duì)皮膚血管化有更好效果的的生物支架材料。 方法: 1、脫細(xì)胞小腸黏膜下層和脫細(xì)胞羊膜的制備：將新鮮豬空腸用清水反復(fù)沖洗，去除外面的漿膜層和肌層，翻轉(zhuǎn)后，去除黏膜層，用NaOH—HCL聯(lián)合方法去細(xì)胞處理，PBS反復(fù)漂洗，冷凍干燥，分裝密封，過(guò)氧乙酸消毒—70度冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。取健康剖腹產(chǎn)的人羊膜，生理鹽水沖

6、凈血跡，反復(fù)漂洗。0.5％SDS，37度震蕩過(guò)夜，0.25％胰酶消化2小時(shí)，反復(fù)PBS漂洗，冷凍干燥分裝密封，過(guò)氧乙酸毒，—70度冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?2、透射掃描電鏡觀察制作的生物支架材料表面情況和孔徑大小。 3、SD大鼠全層皮膚缺損模型的建立：SD大鼠24只，在兩側(cè)背部各做1個(gè)直徑為1.8cm圓形全層皮膚缺損。創(chuàng)面隨機(jī)分為A組、B組和C組。生理鹽水沖洗后，A組HAM覆蓋，B組SIS覆蓋，C組紗布覆蓋。 4、用免疫組

7、織化學(xué)染色法觀察各組大鼠皮膚修復(fù)中K19陽(yáng)性細(xì)胞的分布和VEGF表達(dá)情況。 5、RT-PCR檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組兩周時(shí)VEGFmRNA的表達(dá)情況。 6、結(jié)合圖像采集分析系統(tǒng)，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1、兩種支架材料其表面積容積比足夠大，保證大量細(xì)胞能夠迅速長(zhǎng)入?？紫堵试?

8、0-80％，合適的孔隙大小以及適當(dāng)?shù)目紫堕g連接結(jié)構(gòu)能夠提高細(xì)胞從周圍組織長(zhǎng)入的速度和有效性。 2、宿主的K19陽(yáng)性細(xì)胞在兩種支架材料中的浸潤(rùn)較多，有利于傷口的愈合。 3、兩種支架材料修復(fù)的大鼠皮膚缺損中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)都強(qiáng)于對(duì)照組，且脫細(xì)胞羊膜組的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)強(qiáng)于脫細(xì)胞小腸黏膜下層。 結(jié)論: 有基底膜存在的脫細(xì)胞羊膜增加了SD大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合中K19陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目，增強(qiáng)了的真皮中血管內(nèi)