小腸黏膜下層組織和絲素蛋白-殼聚糖大孔微載體復合骨髓間充質干細胞修復兔耳廓軟骨缺損.pdf

1、目的： 一，建立含有轉化生長因子βi（TGF-β1）的促進骨髓間充質干細胞分化為軟骨細胞的特殊誘導體系，研究在含有TGF-β1等特殊誘導成分培養(yǎng)條件下骨髓間充質干細胞分化為軟骨細胞的能力及其生物學特性。 二．探討采用5-2溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）標記骨髓間充質干細胞技術，標記誘導骨髓間充質干細胞形成的軟骨細胞的可行性。 三，探討通過Transwell技術共培養(yǎng)觀察兔軟骨細胞體外誘導采用BrdU標記的人臍血間充

2、質干細胞分化成軟骨細胞的可行性。 四，探討同種異體小腸黏膜下層支架復合骨髓間充質干細胞誘導成軟骨細胞后修復兔耳廓軟骨缺損的可行性。 五，探討新型絲素蛋白/殼聚糖大孔微載體材料復合同種異體骨髓間充質干細胞修復兔耳廓軟骨缺損的可行性。 方法： 一．TGF-β1特殊軟骨誘導體系建立和觀察方法從兔脛骨結節(jié)內側抽取骨髓，采用貼壁培養(yǎng)法分離純化兔骨髓間充質干細胞并將其加入含有轉化生長因子β1（TGF-β1）和轉鐵蛋白

3、、胰島素、丙酮酸鈉等成分的特殊軟骨誘導體系進行誘導培養(yǎng)；分別對誘導培養(yǎng)14d后的骨髓間充質干細胞及體外培養(yǎng)的第二代人鼻中隔軟骨細胞進行形態(tài)學觀察和免疫組織化學DAB染色Ⅱ型膠原定性檢測。 二、誘導BrdU標記的骨髓間充質干細胞形成軟骨細胞方法將BrdU標記過的兔骨髓間充質干細胞按標記時間的不同，采用臺盼藍標記染色法計算出活細胞率，應用SPSS13．0統(tǒng)計軟件單因素重復測量方法分析進行數(shù)據(jù)處理，比較標記時間長短對兔骨髓間充質細胞活

4、性有無顯著性差異；采用Transwell技術，將BrdU標記過的兔骨髓間充質干細胞與體外培養(yǎng)兔關節(jié)軟骨細胞進行非接觸式共培養(yǎng)，運用免疫組化染色方法檢測共培養(yǎng)體系中兔骨髓間充質干細胞的分化情況，觀察染色結果。 三．誘導BrdU標記的人臍血間充質干細胞分化成軟骨細胞方法由足月順產分娩的新生兒臍靜脈穿刺抽取臍帶血，通過密度梯度法從臍帶血中獲得臍血間充質干細胞并體外培養(yǎng)，通過細胞計數(shù)統(tǒng)計細胞生長數(shù)量，統(tǒng)計數(shù)據(jù)應用SPSS13．0統(tǒng)計軟件

5、以單因素重復測量方法分析整個細胞生長周期各時間段是否存在顯著性差異，總結細胞分化生長規(guī)律；用BrdU標記人臍血干細胞，采用Transwell技術將BrdU標記的人臍血干細胞與兔關節(jié)軟骨細胞非接觸式共培養(yǎng)，誘導人臍血干細胞分化為軟骨細胞，并用免疫組化染色方法進行誘導后細胞類型鑒定。 四．同種異體兔骨髓間充質干細胞/小腸黏膜下層復合物修復兔耳廓缺損方法制備兔小腸黏膜下層；以TGF-β1誘導同種異體兔骨髓間充質干細胞生成的軟骨細胞作為

6、種子細胞，經過處理的同種異體兔片狀小腸黏膜下層作為支架材料，將軟骨細胞/小腸黏膜下層復合物在體外培養(yǎng)7d后種植于兔耳廓缺損處，分別于種植后4、10、16周于缺損區(qū)取材行大體觀察和HE染色、甲苯胺藍染色和Masson's三色染色組織學觀察，了解同種異體兔骨髓間充質干細胞/小腸黏膜下層復合物對兔耳廓缺損組織修復的情況。 五．同種異體骨髓間充質干細胞與絲素蛋白（SF）/殼聚糖（CS）大孔微載體復合物修復兔耳廓缺損方法將SF和CS按照一

7、定比例混合，通過乳化-化學交聯(lián)、冷凍干燥、極性溶液處理制成具有多孔結構的SF/CS大孔微載體；將同種異體骨髓間充質干細胞與SF/CS大孔微載體體外復合培養(yǎng)，倒置顯微鏡每日觀察微載體材料上細胞生長情況，7d后植入兔耳廓缺損區(qū)，分別于8、12周取材行大體觀察和HE染色、Masson's三色染色組織學觀察。 結果： 一．貼壁培養(yǎng)法可分離并純化兔骨髓間充質干細胞，所得第3代骨髓間充質干細胞經誘導培養(yǎng)14d后細胞形態(tài)逐漸變?yōu)閳A形、

8、長菱形及三角形等不規(guī)則形狀、Ⅱ型膠原免疫組織化學染色陽性的軟骨細胞。 二．BrdU標記后的兔骨髓間質干細胞活細胞率在各時間段無顯著性差異（P>0．05），說明BrdU標記時間的長短，對細胞的活性基本沒有影響；兔骨髓間充質干細胞與兔軟骨細胞非接觸式分層培養(yǎng)誘導14d后，細胞胞漿被堿性磷酸酶染色染成典型的藍紫色，細胞核被雙染的DAB染色染成黃色，即Ⅱ型膠原免疫染色陽性的軟骨細胞。 三．在體外培養(yǎng)環(huán)境下，臍帶血間充質干細胞在一

9、定時間內分化生長迅速，傳代后7～13 d細胞處于對數(shù)生長期；16～19 d進入平臺期，擴增速度快于原代培養(yǎng)，倍增時間為8．5 d；細胞周期細胞計數(shù)數(shù)據(jù)采用單因素重復測量方法分析顯示細胞生長周期各組間存在顯著差異（P<0．05），說明細胞增殖旺盛；Brdu標記的人臍帶血間充質干細胞經兔軟骨細胞誘導培養(yǎng)后分化形成的細胞，同正常兔軟骨細胞一樣，經堿性磷酸酶染色和抗Brdu抗體染色雙染，細胞胞質被染成藍紫色，細胞核表現(xiàn)為黃色，說明已被誘導后分化

10、為軟骨細胞。 四，同種異體兔骨髓間充質干細胞經TGF-β1誘導后形成的軟骨細胞/小腸黏膜下層復合物植入體內后，第4周時鏡下顯示復合物周圍有纖維組織形成包膜，新生組織內炎性細胞數(shù)量較多；隨著時間延長，炎性細胞逐漸減少，軟骨細胞數(shù)目和軟骨基質成分逐漸增加；第10周時軟骨陷窩明顯，細胞基質增多，較第4周時軟骨細胞增多；16周時植入?yún)^(qū)有軟骨形成，小腸黏膜下層組織材料被完全吸收，經蘇木精-伊紅染色，Massan染色，甲苯胺蘭染色檢查證實為

11、軟骨組織，但修復層軟骨較薄。 五．SF/CS大孔微載體表面呈多孔的海綿狀球形結構，孔徑為40-80μm；體外培養(yǎng)環(huán)境下，兔骨髓間充質干細胞能夠黏附在微載體的孔壁上生長、繁殖，形成集落性細胞團；接種同種異體兔骨髓間充質干細胞的SF/CS大孔微載體復合物經體外培養(yǎng)7～10d后，植入兔耳廓缺損區(qū)，術后8周時鏡下顯示缺損區(qū)植入的復合物中有基質分泌旺盛、胞體較小的新生軟骨細胞；術后12周時缺損區(qū)由新生軟骨組織填充，新生軟骨細胞接近成熟，但

12、新生軟骨組織較薄，部分區(qū)域填充不均勻。 結論： 一．在含有TGF-β1和轉鐵蛋白、胰島素、丙酮酸鈉等成分的特殊軟骨誘導體系培養(yǎng)條件下，骨髓間充質干細胞可以轉化為免疫組化染色顯示與正常人鼻中隔軟骨細胞無明顯差別的軟骨細胞。 二．采用BrdU標記細胞的方式證明軟骨細胞在體外可定向誘導分化骨髓間充質干細胞成軟骨細胞；BrdU對標記細胞無毒副作用，對細胞增殖分化無影響，為組織工程化軟骨的構建提供一種簡單易行的標記方法。

13、 三．采用BrdU標記的人臍血干細胞經過兔軟骨細胞誘導以后可以分化成軟骨細胞，這種方式為軟骨缺損的組織工程修復提供了又一種軟骨細胞來源。 四．經過處理的同種異體小腸黏膜下層與骨髓間充質干細胞經TGF-β1誘導后生成的軟骨細胞在體外共培養(yǎng)生長，細胞生長良好，細胞相容性好；誘導后生成的同種異體軟骨細胞/小腸黏膜下層復合物在動物體內能夠形成新生軟骨組織，并成功修復軟骨缺損。 五．在體外，絲素蛋白/殼聚糖大孔微載體可與骨髓

14、間充質干細胞共同生長，且細胞相容性良好；絲素蛋白/殼聚糖大孔微載體與同種異體骨髓間充質干細胞所形成的復合物植入有免疫力動物體內軟骨缺損區(qū)可形成軟骨組織并修復軟骨缺損。 意義： 一．本研究建立了含有TGF-β1和轉鐵蛋白、胰島素、丙酮酸鈉等成分的特殊軟骨誘導體系，并采用此體系將骨髓間充質干細胞轉化為軟骨細胞。 二．本研究首先采用Brdu標記細胞的方式證明軟骨細胞在體外可定向誘導分化骨髓間充質干細胞為軟骨細胞的科學性

15、、可行性；Brdu標記做為一種簡單的標記方法可以更廣泛地應用于組織工程明確細胞性質的研究中。 三．采用Brdu標記的人臍血干細胞經過軟骨誘導以后可以分化成軟骨細胞，這種方法為軟骨缺損的組織工程修復、重建提供了又一軟骨細胞來源，尚未見報導。 四．本研究證明經過處理的同種異體小腸黏膜下層與骨髓間充質干細胞經TGF-β1誘導后生成的軟骨細胞在體外共培養(yǎng)生長，細胞生長良好，細胞相容性好；軟骨細胞/小腸黏膜下層復合物在動物體內能夠