電刺激小腦頂核對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子及其受體的影響.pdf

1、新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是指在圍產(chǎn)期窒息缺氧等因素導(dǎo)致腦的缺氧缺血性損害，臨床上出現(xiàn)一系列腦病的表現(xiàn)。重度患兒常遺留腦癱、癲癇、智力障礙、共濟(jì)失調(diào)等后遺癥，給家庭和社會(huì)造成極大的負(fù)擔(dān)。因此，尋找有效的防治HIBD方法對(duì)于提高新生兒的存活率，降低致殘率，搞好優(yōu)生優(yōu)育，提高我國(guó)人口素質(zhì)，具有重要的意義。
　　 缺氧缺血后腦組織血運(yùn)供應(yīng)的改善與神經(jīng)元功能的恢復(fù)密切相

2、關(guān)。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一組近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的血管新生因子，是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能細(xì)胞因子，也是血管發(fā)生和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，不僅能促進(jìn)血管的新生，還能直接作用于神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)的作用。
　　 目的
　　 近年來(lái)，物理治療方法如電刺激、功能訓(xùn)練、針灸、按摩等在腦缺血疾病的治療過(guò)程中越來(lái)越受到重視，而電刺激目前治療成年腦

3、缺血性疾病的療效已得到肯定，但對(duì)HIE恢復(fù)期的療效在國(guó)內(nèi)外卻少有報(bào)道，更缺少實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制作新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型，給予電刺激其小腦項(xiàng)核，利用免疫組化方法來(lái)觀察腦組織中VEGF及其受體的表達(dá)，并通過(guò)記憶能力測(cè)試，探討電刺激對(duì)腦保護(hù)作用的機(jī)制。
　　 材料與方法
　　 1.分組
　　 新生7日齡健康SD大鼠105只，雌雄不限，體重12-16g，隨機(jī)分成A、B兩組。每組又分為對(duì)照組、模型組、電刺激組，A

4、組各25只，B組各10只。A組在造模術(shù)后又按1天、3天、7天、14天、21天隨機(jī)分成5組，每組各5只。
　　 2.Rice法模型制作
　　 新生7日齡健康SD大鼠，乙醚吸入麻醉，取頸左側(cè)切口，游離左頸總動(dòng)脈，用絲線結(jié)扎，縫合切口，置于缺氧箱中，持續(xù)充以氣流量為2L/min的8：92氧氮混合氣體2h。對(duì)照組僅分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎也不缺氧。術(shù)后夾尾左旋是制模成功的標(biāo)志，據(jù)此納入實(shí)驗(yàn)。
　　 3.電刺激治療方法<

5、br>　　 電刺激組在術(shù)后12 h開(kāi)始刺激治療，每次電刺激30分鐘，刺激部位為耳后相當(dāng)于人乳突處，每日1次，電刺激強(qiáng)度為3.5V、頻率50HZ，使大鼠肢體稍有震顫為宜。對(duì)照組與模型組不予電刺激治療，僅予相應(yīng)時(shí)段捕捉固定。
　　 4.標(biāo)本采集與制備
　　 A組三組大鼠每組分別于術(shù)后1天、3天、7天、14天、21天隨機(jī)各取5只大鼠，應(yīng)用乙醚麻醉后，剪開(kāi)胸腔，暴露心臟，剪開(kāi)右心耳，以20ml注射器連接5號(hào)頭皮針經(jīng)左心室心尖部

6、先灌注9g/L鹽水50ml，然后灌注40g/L多聚甲醛溶液。沿頸部斷頭，眼科鑷剝離顱骨，離斷視神經(jīng)和延髓完整取出腦組織，取以海馬為中心的腦組織，40g/L多聚甲醛固定24h，將腦組織沿視交叉和正中隆起處做冠狀切開(kāi)，分別做冠狀切片，進(jìn)行VEGF及VEGFR1、VEGFR2的免疫組化檢測(cè)，并對(duì)切片進(jìn)行病理學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)。
　　 5.指標(biāo)測(cè)定
　　 5.1腦組織HE染色
　　 光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。
　　 5.2

7、腦組織VEGF及VEGFR1、VEGFR2的測(cè)定
　　 高倍光鏡下觀察大鼠海馬區(qū)VEGF及VEGFR1、VEGFR2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)，胞核染成棕黃色者判為陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物。利用Image-pro plus6.0軟件系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行平均光密度測(cè)定，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，取其平均值。
　　 5.3記憶能力測(cè)試
　　 采用Y迷宮實(shí)驗(yàn)。于手術(shù)后第28天對(duì)B組各組大鼠進(jìn)行迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試，以連續(xù)10次測(cè)試中有9次正確的反應(yīng)為達(dá)到

8、學(xué)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)，記錄每一動(dòng)物迷路分辨學(xué)習(xí)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)前所需要的測(cè)試數(shù)和正確反應(yīng)率。24 h后重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)的過(guò)程。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：
　　 采用SPSS for windows13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方法為單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)均以x±s表示，以α=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.HE染色結(jié)果：
　　 對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞排列整齊緊密，

9、細(xì)胞核清楚，核仁明顯，胞漿染色均勻，胞膜完整。模型組海馬區(qū)錐體細(xì)胞變性，細(xì)胞間隙增大，排列紊亂，正常神經(jīng)元減少，可見(jiàn)大量明顯的壞死灶，壞死中心區(qū)呈空泡樣變，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，胞質(zhì)皺縮，核濃縮深染，核仁消失，胞漿疏松，間質(zhì)水腫。電刺激組神經(jīng)細(xì)胞變性壞死較少，損傷程度明顯減輕，海馬區(qū)錐體細(xì)胞及神經(jīng)元存活數(shù)量多，多數(shù)細(xì)胞形態(tài)相對(duì)正常。
　　 2.VE6F、VE6FR1、VE6FR2免疫組化染色：
　　 電刺激組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)VEG

10、F及VEGFR1、VEGFR2表達(dá)均高于模型組和對(duì)照組(P<0.05)；模型組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)VEGF及VEGFR1、VEGFR2表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.05)；電刺激組和模型組VEGF表達(dá)于第3天達(dá)高峰，持續(xù)14天開(kāi)始下降至21天仍有表達(dá)，VEGFR1、VEGFR2表達(dá)于第7天達(dá)到高峰，持續(xù)14天開(kāi)始下降至21天仍有表達(dá)；對(duì)照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的VEGF及VEGFR1、VEGFR2表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　 3.記憶能力測(cè)試

11、：
　　 模型組大鼠第1天達(dá)標(biāo)所需反應(yīng)次數(shù)顯著多于對(duì)照組，正確反應(yīng)率顯著低于對(duì)照組，第2天復(fù)測(cè)仍有相似結(jié)果，而電刺激組第1天達(dá)標(biāo)所需反應(yīng)次數(shù)顯著低于模型組，正確反應(yīng)率也顯著高于模型組，各組相比均有顯著意義(P<0.05)；在模型組，第2天正確率未見(jiàn)明顯提高，與第1天相比P>0.05，余均見(jiàn)明顯提高(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.電刺激可促進(jìn)HIBD新生大鼠腦組織VEGF及其受體VEGFR1、VEGFR