治療型脂膜超聲微泡的制備方法學(xué)研究.pdf

1、背景： 利用超聲能量非創(chuàng)傷性治療腫瘤一直是業(yè)界追求的目標(biāo)。近年，針對(duì)微泡超聲空化的一系列研究發(fā)現(xiàn)，微泡空化具有潛在的治療作用，主要表現(xiàn)在微泡的藥物載體作用和超聲空化增強(qiáng)作用兩方面。微泡超聲空化不僅能導(dǎo)致局部組織通透性增高，而且能增強(qiáng)藥物傳遞和滲透，具有非創(chuàng)傷性治療腫瘤的潛力。 已知陰離子脂膜微泡表面帶有負(fù)電荷，在循環(huán)中通過補(bǔ)體C3b介導(dǎo)的免疫粘附更容易粘附滯留于微血管壁，數(shù)量比中性微泡高10倍。這樣，在超聲空化時(shí)陰離子微

2、泡與微血管壁的距離可能較中性微泡更貼近，空化發(fā)生時(shí)容易產(chǎn)生更顯著的生物學(xué)效應(yīng)。本研究設(shè)想，利用陰離子脂膜微泡結(jié)合凝血酶原復(fù)合物，制備成結(jié)合凝血酶原復(fù)合物的陰離子脂膜微泡。利用陰離子微泡的血管內(nèi)皮粘附能力聯(lián)合超聲空化，在損傷腫瘤微血管內(nèi)皮同時(shí)釋放凝血酶原復(fù)合物，促進(jìn)局部微循環(huán)血栓形成，栓塞阻斷腫瘤微循環(huán)，從而達(dá)到非創(chuàng)傷性治療腫瘤的目的。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，制備陰離子脂膜微泡并結(jié)合凝血酶原復(fù)合物是前期的必要工作。 目的： 首先

3、，探討通過改變脂質(zhì)配方、增加負(fù)電荷脂質(zhì)成分，增強(qiáng)脂膜微泡表面負(fù)電荷的可能性；其次，對(duì)制備的陰離子微泡進(jìn)行理化檢測(cè)，包括：微泡表面電位、濃度、粒徑等；第三，陰離子脂膜微泡結(jié)合凝血酶原復(fù)合物的嘗試，采用直接連接法和親和素-生物素法，并對(duì)該微泡的理化性質(zhì)、凝血酶原復(fù)合物與微泡的結(jié)合情況、穩(wěn)定性及所結(jié)合凝血酶原復(fù)合物的凝血活性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。 方法： 1.陰離子脂膜微泡的制備：通過改變配方中脂質(zhì)成分比例以及聚乙二醇(PEG)的用量

4、設(shè)計(jì)三種配方：配方1以中性磷脂為主，負(fù)電荷磷脂少，PEG為支架物質(zhì)；配方2以負(fù)電荷磷脂為主，中性磷脂少，PEG為支架物質(zhì)；配方3以負(fù)電荷磷脂為主，中性磷脂少，以甘露醇為支架物質(zhì)替代PEG。機(jī)械振蕩法制備三種配方微泡后，觀察微泡形態(tài)、大小，并測(cè)定其濃度、表面電位、PH值、粒徑及分布。 2.陰離子脂膜微泡與凝血酶原復(fù)合物的連接1)直接連接法：①制備結(jié)合熒光標(biāo)記凝血酶原復(fù)合物(PCC)的陰離子脂膜微泡，標(biāo)記物為異硫氰酸熒光素(FITC

5、)。配方2、3(陰離子微泡配方)各分三組：第一組，機(jī)械振蕩法制備陰離子脂膜微泡；第二組，機(jī)械振蕩前加入FITC-PCC溶解液，然后機(jī)械振蕩；第三組，機(jī)械振蕩法制備陰離子脂膜微泡后加入FITC-PCC溶解液，再經(jīng)漩渦混合振蕩儀混勻。上述制備完成后孵育30min，取一半采用浮選法洗滌，另一半靜置，分別觀察或測(cè)定洗滌前后各組微泡大小、形態(tài)、濃度、微泡熒光亮度，流式細(xì)胞儀檢測(cè)微泡與FITC-PCC的結(jié)合率。②制備結(jié)合PCC的陰離子脂膜微泡。經(jīng)檢

6、測(cè)證實(shí)FITC-PCC與微泡結(jié)合后，采用非熒光標(biāo)記的PCC替換FITC-PCC，重復(fù)上述步驟制備。全自動(dòng)凝血儀檢測(cè)微泡結(jié)合的PCC中Ⅸ因子的凝血活性，并與相同濃度PCC溶液中Ⅸ因子的活性對(duì)照。2)親和素-生物素法：①直接連接法制備結(jié)合鏈酶親和素(SA)的陰離子脂膜微泡，SA用吲哚碳花青甙熒光素(Cy3)標(biāo)記，將配方2、3(陰離子微泡配方)各分五組：第一組，機(jī)械振蕩法制備陰離子脂膜微泡；第二組，機(jī)械振蕩前加入Cy3-SA，然后機(jī)械振蕩；第

7、三組，機(jī)械振蕩法制備陰離子脂膜微泡后加入Cy3-SA，再經(jīng)漩渦混合振蕩儀混勻；第四組、第五組將機(jī)械振蕩替換為超聲振蕩，基本步驟第四組同第二組、第五組同第三組。上述制備完成后孵育30min，取一半采用浮選法洗滌，另一半靜置，分別觀察或檢測(cè)洗滌前后各組微泡大小、形態(tài)、濃度、微泡熒光亮度、微泡與SA的結(jié)合率。②制備結(jié)合PCC的陰離子脂膜微泡。經(jīng)檢測(cè)證實(shí)Cy3-SA與微泡結(jié)合后，重復(fù)上述分組，將各組制備的陰離子脂膜微泡分別與生物素化PCC混合、

8、孵育30min，分別觀察各組微泡大小、形態(tài)、濃度。檢測(cè)不同濃度生物素化PCC中Ⅸ因子的活性。 結(jié)果： 1.陰離子脂膜微泡的制備：三種配方對(duì)脂膜微泡的濃度、體外穩(wěn)定性幾乎無影響，但對(duì)脂膜微泡的電荷特性有明顯影響。三種配方所制備微泡的粒徑均值分別為1066.6nm、1605.4nm、1552.5nm；微泡表面電位均值：在蒸餾水中分別為-33.8mV、-57.6mV、-66.7mV，在生理鹽水中分別為0.1mV、-37.5mV

9、、-37.8mV。與配方1比較，配方2、3所制備微泡大小適中、表面帶有更多負(fù)電荷(P＜0.01)，配方2、3間比較差異無顯著性意義(P＞0.05)。 2.直接連接法制備結(jié)合PCC的陰離子脂膜微泡：①與第一組(空白組)比較，第二組(機(jī)械振蕩前加入FITC-PCC)、第三組(機(jī)械振蕩后加入FITC-PCC)制備的微泡濃度、粒徑及粒徑分布無明顯變化，但易靜置分層；②熒光顯微鏡觀察：洗滌前結(jié)合FITC-PCC的各組微泡均能激發(fā)出明亮的綠

10、色熒光，洗滌后微泡濃度由1010左右降到107左右，微泡熒光亮度由“3級(jí)”變?yōu)椤?級(jí)”；③微泡與PCC的結(jié)合率：洗滌前或洗滌后各組間比較均差異無顯著性意義(P＞0.05)，但洗滌后結(jié)合率均值由洗滌前的95％左右降為80％左右(P＜0.05)；④Ⅸ因子凝血活性檢測(cè)：洗滌前結(jié)合PCC的各組微泡均能保持較高活性，與相同濃度的PCC溶液比較差異無顯著性意義(P＞0.05)，各組間亦差異無顯著性意義(P＞0.05)，洗滌后各組間仍差異無顯著性意義

11、(P＞0.05)，但活性明顯下降，由洗滌前的90％左右降為19％左右(P＜0.01)；⑤配方2、3各組間比較均差異無顯著性意義(P＞0.05)。 3.親和素-生物素法制備結(jié)合PCC的陰離子脂膜微泡：(1)直接連接法制備結(jié)合SA的陰離子脂膜微泡：①與第一組(空白組)比較，第二組、第三組(機(jī)械振蕩法)制備的微泡濃度、粒徑及粒徑分布無明顯變化，但易靜置分層；與第二、三組比較，第四組、第五組(超聲振蕩法)制備的微泡粒徑稍大，但濃度偏低，

12、且易靜置分層；第四、五組間比較差異無顯著性意義。②熒光顯微鏡觀察：結(jié)合Cy3-SA的各組微泡均能激發(fā)出明亮的紅色熒光(3級(jí))，洗滌三次后微泡濃度雖明顯降低，但熒光亮度無明顯改變。③微泡與SA的結(jié)合率：洗滌前后比較及組間比較均差異無顯著性意義(P＞0.05)，結(jié)合率均值高達(dá)98％左右。配方2、3各組間比較均差異無顯著性意義無顯著性意義(P＞0.05)。(2)親和素-生物素法制備結(jié)合PCC的陰離子脂膜微泡：①微泡外觀、粒徑、濃度與結(jié)合SA的

13、微泡比較無明顯區(qū)別；②Ⅸ因子凝血活性檢測(cè)：生物素化后PCC中Ⅸ因子活性明顯減低(降低約93％)。 結(jié)論： 1.增加脂質(zhì)成分中負(fù)電荷磷脂的比例，可制備出表面帶有更多負(fù)電荷的陰離子脂膜微泡。 2.直接連接法可制備結(jié)合凝血酶原復(fù)合物的陰離子脂膜微泡，微泡與凝血酶原復(fù)合物結(jié)合率較高，且能保持較高的活性，但易靜置分層。 3.直接連接法可使鏈酶親和素與陰離子脂膜微泡很好地結(jié)合，但是生物素化可能破壞凝血酶原復(fù)合物的活性