eIF4E在人非小細胞肺癌中的作用及其對Pim-1表達調(diào)控的實驗研究.pdf

1、目的:在全球范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率及死亡率位于常見惡性腫瘤的前列，揭示其病因及發(fā)病機制對于肺癌的有效治療意義重大。我們前期研究表明，Pim-1在非小細胞肺癌組織(Non-small-cell lung cancer, NSCLC)中過表達，并且其過表達可以促進NSCLC細胞的增殖以及腫瘤遷移等過程，發(fā)揮癌基因的作用。但是，目前有關(guān)Pim-1在NSCLC中過表達的機制尚不清楚。真核細胞翻譯起始因子4E(eIF4E)作為重要的真核細胞翻譯起始

2、因子，可增加一些癌基因在蛋白水平的合成過程。eIF4E是否參與NSCLC中Pim-1的表達調(diào)控尚不清楚。鑒于此，本實驗旨在研究eIF4E在NSCLC中的表達及作用，同時分析eIF4E對Pim-1表達的調(diào)控作用。
　　方法:
　　1、免疫組織化學(xué)方法
　　采用免疫組織化學(xué)ElivisionTMplus三步法，檢測Pim-1與eIF4E蛋白在福爾馬林固定石蠟包埋NSCLC組織中的表達。在此基礎(chǔ)上，分析Pim-1與eIF4E

3、表達與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，并對二者表達的相關(guān)性進行分析。
　　2細胞培養(yǎng)
　　人肺癌細胞H1299、A549、H157、H460和H358，培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2培養(yǎng)，細胞貼壁生長。取對數(shù)生長期的培養(yǎng)細胞，用0.25％胰蛋白酶+0.02％ EDTA消化，進行細胞傳代以及細胞的收集，進行相關(guān)研究。
　　3 siRNA轉(zhuǎn)染
　　

4、使用100 pmol eIF4E特異性siRNA瞬時轉(zhuǎn)染H1299和A549細胞，同時轉(zhuǎn)染Negtive control siRNA(NC siRNA)作為陰性對照。體外觀察eIF4E在NSCLC中的作用及對Pim-1的表達的影響。
　　4 MTT比色法
　　分別于eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染后0h、24 h、48h、72h和96h，采用MTT方法檢測對H1299及A549細胞的生長情況;不同濃度吉非替尼處理48h后進行MTT

5、檢測，繪制細胞生長曲線并計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。此外，分別于Pim-1 siRNA或eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合吉非替尼(gefitinib)處理細胞后進行MTT檢測。
　　5蛋白免疫印跡(Western blot)
　　eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染H1299、A549細胞48h后提取細胞總蛋白，采用蛋白免疫印跡方法檢測eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染后eIF4E和Pim-1蛋白表達情況，并計算其相對表達量。采用Odysse

6、y儀器進行顯色分析，Bio-LD圖像分析系統(tǒng)進行定量分析。
　　6 Real-time PCR
　　轉(zhuǎn)染處理H1299和A549細胞48h后，應(yīng)用Real-time PCR方法檢測細胞中Pim-1和eIF4E mRNA的表達情況。采用Applied Biosystems公司提供的Comparative Ct(△△Ct)方法計算，計算目的基因的相對表達量。
　　7統(tǒng)計
　　應(yīng)用SPSS Statistics17.0

7、軟件，數(shù)據(jù)分析采用兩樣本t檢驗、x2檢驗、spearman等級相關(guān)分析及曲線擬合;計量資料以均數(shù)±標準差（(x)±SD）表示。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1 eIF4E蛋白在NSCLC組織中的表達及與臨床病理特征的關(guān)系
　　免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，eIF4E蛋白的陽性著色定位于腫瘤細胞的胞漿中。在69例NSCLC石蠟組織中有56例呈陽性表達，陽性表達率為81.1％(56/69)。進一步分析發(fā)

8、現(xiàn)，eIF4E蛋白的表達與腫瘤大小密切相關(guān)(P=0.036)，但是與其他重要臨床病理特征無顯著相關(guān)性(P＞0.05)。
　　2 eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染對NSCLC細胞生長與遷移的影響
　　體外培養(yǎng)A549和H1299細胞，將eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染細胞后，從細胞生長與遷移方面觀察eIF4E在NSCLC中可能的作用。
　　2.1 eIF4E siRNA干擾效率的檢測
　　我們選取eIF4E蛋白高表達的A549

9、和H1299細胞進行eIF4E siRNA干擾實驗，于轉(zhuǎn)染后48小時收集細胞進行干擾效率的檢測。Real-time PCR結(jié)果顯示，與NC siRNA對照組相比，eIF4E mRNA的表達在A549細胞和H1299細胞eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染組細胞中分別降低了83％和80％。 Western blot檢測結(jié)果同樣表明，eIF4E蛋白的表達在eIF4EsiRNA轉(zhuǎn)染組明顯低于對照組。上述結(jié)果表明，所用eIF4E siRNA序列可以有效干

10、擾eIF4E的表達。
　　2.2 eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染對細胞生長作用的影響
　　MTT檢測結(jié)果表明，A549及H1299細胞的存活率在eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染后48h、72h和96h時均明顯低于對照組（P＜0.05），并且隨著時間增加抑制細胞生長的作用越明顯。結(jié)果提示，敲低eIF4E表達可抑制A549和H1299細胞的生長。
　　2.3 eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染對細胞遷移力的影響
　　細胞劃痕實驗結(jié)果表

11、明，于劃痕后48h，可見eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染組A549和H1299細胞朝向劃痕遷移的速度明顯低于對照組細胞。結(jié)果表明敲低eIF4E表達可抑制細胞的遷移能力。
　　3 eIF4E對體外培養(yǎng)A549和H1299細胞Pim-1表達的影響
　　為進一步探討eIF4E對Pim-1在肺癌中表達的作用，我們采用siRNA干擾技術(shù)，將eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染A549和H1299細胞，從RNA和蛋白水平上對二者表達的關(guān)系進行研究。

12、r>　　Real-time PCR結(jié)果顯示，與NC siRNA對照組相比，eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染組A549和H1299細胞中Pim-1在mRNA水平的表達無顯著變化。但是，Western blot檢測結(jié)果表明，Pim-1蛋白的表達在eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染組明顯低于對照組，尤其A549細胞下降更為明顯。結(jié)果提示，敲低eIF4E表達可顯著抑制細胞中Pim-1蛋白的表達。
　　4 eIF4E與Pim-1蛋白在NSCLC組織中表達

13、的相關(guān)性分析
　　4.1 Pim-1蛋白在NSCLC組織中的表達及與臨床病理特征的關(guān)系
　　免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，Pim-1蛋白的陽性著色部位定位于腫瘤細胞胞核和（或）胞漿。在77例NSCLC組織中有51例陽性表達，陽性表達率為66.2％(51/77)，21例正常肺組織中僅有3例陽性表達，陽性表達率為14.3％(3/21)，表明腫瘤組織中Pim-1蛋白的表達顯著高于正常組織（P＜0.001）。并且Pim-1蛋白的表達和腫

14、瘤組織學(xué)類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠端轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)(P＜0.05)。
　　4.2 Pim-1蛋白和eIF4E蛋白表達的相關(guān)性分析
　　在69例NSCLC標本中，Pim-1和eIF4E共同陽性例數(shù)有43例，共同陰性有11例。利用spearman等級相關(guān)分析(Spearman's rank test)發(fā)現(xiàn)，二者表達具有顯著的正性相關(guān)關(guān)系（r=0.504， P＜0.001）。
　　5 eIF4E/Pim-1 si

15、RNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合gefitinib處理對A549和H1299細胞生長的影響
　　5.1繪制gefitinib對A549和H1299細胞的生長曲線
　　采用MTT檢測并利用曲線擬合(curve fitting)繪制細胞生長曲線，計算半數(shù)抑制濃度(IC50)值確定gefitinib最適的作用濃度。結(jié)果表明，gefitinib對H1299、A549細胞的IC50分別為20.17μM和10.56μM，所以我們分別用20μM和10μM處

16、理H1299和A549細胞進行后續(xù)實驗。
　　5.2 eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合gefitinib處理對細胞生長的影響
　　MTT檢測結(jié)果表明，A549細胞給予eIF4E siRNA聯(lián)合gefitinib處理后72小時，可見細胞存活率顯著低于NC siRNA聯(lián)合gefitinib處理組細胞（P＜0.05）。此外，給予H1299細胞eIF4E siRNA聯(lián)合gefitinib處理后48h和72h，均可見細胞存活率顯著低于N

17、C siRNA聯(lián)合gefitinib處理組（P＜0.05）。上述結(jié)果提示eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染可以增加腫瘤細胞對靶向治療藥物gefitinib的敏感性。
　　5.3 Pim-1 siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合gefitinib處理對細胞生長的影響
　　MTT檢測結(jié)果表明，A549細胞給予Pim-1 siRNA聯(lián)合gefitinib處理后48h和72小時，可見細胞細胞存活率顯著低于NC siRNA聯(lián)合gefitinib處理組細胞(P＜

18、0.05)。此外，給予H1299細胞給予Pim-1 siRNA聯(lián)合gefitinib處理72h，均可見細胞存活率顯著低于NC siRNA聯(lián)合gefitinib處理組(P＜0.05)。上述結(jié)果提示Pim-1 siRNA轉(zhuǎn)染可以增加腫瘤細胞對gefitinib的敏感性。
　　結(jié)論:
　　1、eIF4E蛋白在人非小細胞肺癌組織中呈高表達，并且其表達與腫瘤大小顯著相關(guān)。體外敲低eIF4E表達可顯著抑制A549和H1299細胞的生長與