BMP2和VEGF基因共修飾的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在低氧條件下成骨能力研究.pdf

1、目的:
　　 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Protein2,BMP2)是目前已知的具有最強(qiáng)促進(jìn)異位成骨能力細(xì)胞因子,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growthfactor,VEGF)能顯著促進(jìn)血管再生有利于骨缺損的愈合。BMP2和VEGF兩種蛋白的分泌存在相互促進(jìn)的正反饋?zhàn)饔?。骨缺損的愈合,尤其是在愈合過(guò)程的初期,是在低氧環(huán)境下進(jìn)行的。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow

2、 Stromal Cells,BMSC)具有向骨形成細(xì)胞和血管形成細(xì)胞等多種細(xì)胞分化的潛能。本課題研究模擬低氧環(huán)境下同時(shí)轉(zhuǎn)染hBMP2和VEGF基因的BMSC在成骨方面的相關(guān)特性。
　　 方法:
　　 1.大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的分離、培養(yǎng)
　　 利用Percoll分離液(相對(duì)密度1.077),用密度梯度離心法從大鼠骨髓中分離骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,進(jìn)行體外培養(yǎng)及擴(kuò)增。
　　 2.通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和生長(zhǎng)曲線

3、的測(cè)定及Elisa,觀察BMSC轉(zhuǎn)染hBMP-2的腺病毒載體(Ad-hBMP-2)和VEGF的腺病毒載體(Ad-VEGF)后生物學(xué)行為的變化和目的基因的表達(dá)。
　　 BMSC轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的腺病毒載體(Ad-GFP)后,使用熒光顯微鏡來(lái)測(cè)定腺病毒的轉(zhuǎn)染效率,并觀測(cè)轉(zhuǎn)染Ad-GFP的細(xì)胞傳代后綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。
　　 3.MTT法檢測(cè)低氧控制系統(tǒng)下,轉(zhuǎn)染

4、Ad-hBMP-2和VEGF的BMSC細(xì)胞增值及活力
　　 取第二代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)分為四組:(1)BMSC培養(yǎng)組;(2)Ad-hBMP-2+BMSC培養(yǎng)組;(3)VEGF+BMSC培養(yǎng)組;(4)Ad-hBMP-2+VEGF+BMSC培養(yǎng)組。體外連續(xù)培養(yǎng)7天,分別在此期間內(nèi)用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增值能力,酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值(OD值),每個(gè)樣本設(shè)六個(gè)復(fù)孔,求其平均值并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　 4.低氧控制系統(tǒng)

5、下,檢測(cè)轉(zhuǎn)染Ad-hBMP-2和VEGF的BMSC成骨能力
　　 取第二代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)分為四組:(1)BMSC培養(yǎng)組;(2)Ad-hBMP-2+BMSC培養(yǎng)組;(3)VEGF+BMSC培養(yǎng)組;(4)Ad-hBMP-2+VEGF+BMSC培養(yǎng)組。96孔板內(nèi)于低氧控制系統(tǒng)下,連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6天,分別在此6天內(nèi)用PNPP法檢測(cè)各組細(xì)胞的堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)的活性的表達(dá):酶標(biāo)儀測(cè)定

6、光密度值(OD值),每個(gè)樣本設(shè)五個(gè)復(fù)孔,求其平均值,并繪制ALP活性增長(zhǎng)曲線;6孔板內(nèi)四組樣本體外連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)7天,在第7天行茜素紅染色,觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.密度梯度離心法,可獲取高純度的BMSC,并且細(xì)胞活性較好。貼壁3天后細(xì)胞成長(zhǎng)為梭形及多角形,5、6天后增殖迅速,形成細(xì)胞集落。傳代后細(xì)胞形態(tài)更加單一,5、6天后即可鋪滿(mǎn)瓶底。
　　 2.體外實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。Ad-GFP轉(zhuǎn)染

7、12小時(shí)后即可檢測(cè)到綠色熒光蛋白表達(dá),轉(zhuǎn)染2天后平均轉(zhuǎn)染效率為90％,傳至5代后依然可檢測(cè)到綠色熒光蛋白表達(dá)。
　　 3.MTT法檢測(cè)低氧控制系統(tǒng)下,轉(zhuǎn)染Ad-hBMP-2和Ad-VEGF的BMSC細(xì)胞增值及活力顯示:第1、2天各組細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有明顯增加,各組間細(xì)胞增殖能力統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05);第3天后,各組細(xì)胞數(shù)量明顯增加,轉(zhuǎn)染Ad-hBMP-2的細(xì)胞增殖能力在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著高于其他培養(yǎng)組(P＜0.01),轉(zhuǎn)染A

8、d-VEGF細(xì)胞增殖能力與空白組無(wú)顯著性差別(P＞0.05)。
　　 4.低氧控制系統(tǒng)下,檢測(cè)轉(zhuǎn)染Ad-hBMP-2和VEGF的BMSC成骨能力
　　 1)PNPP法檢測(cè)各組ALP活性表達(dá),結(jié)果顯示:Ad-hBMP-2+VEGF+BMSC培養(yǎng)組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后,ALP活性表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著高于其他三組(P＜0.05);Ad-hBMP-2+BMSC成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組高于BMSC組和VEGF+BMSC組(P＜0.05);BMSC

9、組和VEGF+BMSC組無(wú)顯著差別(P＜0.05)。
　　 2)低氧控制系統(tǒng)下,4組樣本培養(yǎng)7天后,茜素紅染色結(jié)果顯示:Ad-hBMP-2+VEGF+BMSC成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組細(xì)胞密集生長(zhǎng)區(qū)有多量礦化結(jié)節(jié)形成,茜素紅染色成橘紅色。Ad-hBMP-2+BMSC和VEGF+BMSC成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組細(xì)胞有少量礦化結(jié)節(jié)。BMSC成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組只有零星幾個(gè)礦化結(jié)節(jié)。
　　 結(jié)論:
　　 在一周的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),骨形態(tài)形成蛋白(Bon