補(bǔ)脾腎活血泄?jié)嶂兴帉?duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖和調(diào)亡的影響.pdf

1、慢性腎衰竭(CRF)是各種病因引起慢性腎臟損害進(jìn)行性惡化的結(jié)果。西方發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)CRF特別是終末期腎臟病的治療，多采用透析及腎移植的方法，但由于其價(jià)格昂貴及其本身存在的局限性，在我國(guó)仍未實(shí)現(xiàn)廣泛應(yīng)用。如何有效地干預(yù)、延緩CRF的發(fā)生發(fā)展一直是防治CRF中極待解決的問(wèn)題。CRF早期病變主要表現(xiàn)為腎小球系膜細(xì)胞(MC)和/或細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的異常增多，晚期常不可逆轉(zhuǎn)的進(jìn)展為腎小球硬化(GS)，并引起嚴(yán)重的腎功能障礙。因而遏制腎小球MC細(xì)胞

2、和ECM的過(guò)度增生是有效延緩GS、防治CRF的關(guān)鍵。 腎小球MC是腎小球中最活躍的固有細(xì)胞，是分泌ECM的主要細(xì)胞。研究證實(shí)過(guò)度增生的腎小球MC能合成、分泌多種基質(zhì)成分；腎小球MC增殖同時(shí)伴隨ECM的積聚。腎小球MC的過(guò)度增殖和其導(dǎo)致的ECM過(guò)度積聚可以導(dǎo)致毛細(xì)血管被擠壓、閉塞、腎小球?yàn)V過(guò)減少，最終導(dǎo)致GS。通過(guò)抑制腎小球MC增殖可減少ECM在腎小球的積聚，從而延緩GS的進(jìn)展。 細(xì)胞調(diào)亡和細(xì)胞增殖共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡狀

3、態(tài)。隨著對(duì)細(xì)胞凋亡研究的不斷深入，認(rèn)識(shí)到細(xì)胞調(diào)亡機(jī)制在腎臟病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要作用。在CRF早期增殖性病變階段，腎小球MC過(guò)度增殖的同時(shí)也伴隨有細(xì)胞調(diào)亡機(jī)制的缺失，因而可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡機(jī)制促進(jìn)增殖的腎小球MC調(diào)亡，進(jìn)而減少ECM積聚[8][[9]，發(fā)揮延緩GS的作用。 目前還未發(fā)現(xiàn)安全有效的抗GS的藥物，而中藥來(lái)源廣泛，在臨床應(yīng)用中也能明顯降低患者的尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)水平、改善CRF臨床癥狀，延緩GS的進(jìn)

4、展。因此，研究中藥抗GS的機(jī)制具有重要的臨床意義。本課題旨在通過(guò)研究補(bǔ)脾腎活血泄?jié)嶂兴帉?duì)腎小球MC細(xì)胞增殖和調(diào)亡的影響，探討其延緩GS的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥防治CRF提供理論依據(jù)。 第一部分補(bǔ)脾腎活血泄?jié)嶂兴帉?duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響 目的：觀察補(bǔ)脾腎活血泄?jié)嶂兴帉?duì)體外培養(yǎng)的大鼠腎小球MC細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制的探討。 方法：體外培養(yǎng)的大鼠腎小球MC系，分別經(jīng)含低、高劑量的補(bǔ)脾腎活血泄?jié)嶂兴?以下稱中藥)血

5、清和含依那普利(以下稱西藥)血清培養(yǎng)液處理后，分別從以下幾個(gè)方面研究中藥對(duì)大鼠腎小球MC細(xì)胞的影響： 1、臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)大鼠腎小球MC的活力：待檢細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活力。 2、MTT比色法測(cè)定大鼠腎小球MC的增殖：待檢細(xì)胞分別于培養(yǎng)結(jié)束前6小時(shí)加入MTT。培養(yǎng)結(jié)束后，加入二甲亞砜(DMSO)，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)吸光度值A(chǔ)(570nm處)。 3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠腎小球MC的周期：收集待檢細(xì)

6、胞后，離心5分鐘，經(jīng)冰乙醇固定，PBS洗滌后用RNAse37℃孵育30分鐘，PI染色30分鐘，上FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。 結(jié)果： 1.臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示：10％中、西藥物血清作用于大鼠腎小球MC24小時(shí)、48小時(shí)后，細(xì)胞活力均在96％以上，表明10％濃度的中、西藥血清對(duì)大鼠腎小球MC無(wú)明顯細(xì)胞毒作用。 2.MTT比色法測(cè)定結(jié)果顯示：中藥低、高劑量血清在作用24、48小時(shí)后與正常大鼠血清OD值

7、相比具有顯著性差異(P＜0.01)，提示低、高劑量中藥能明顯抑制大鼠MC增殖且呈量效依賴性。中藥低、高劑量血清在作用24小時(shí)、48小時(shí)后與西藥血清OD值相比具有顯著性差異(P＜0.01)，提示低、高劑量中藥比西藥能明顯抑制大鼠腎小球MC增殖。不同時(shí)間段內(nèi)中藥低劑量血清組或高劑量血清組，OD值相比沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，提示中藥抑制大鼠MC增殖作用不隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而有顯著變化。 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：低、高劑量中藥

8、血清作用24小時(shí)后，細(xì)胞周期的分布發(fā)生了變化，G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例降低，與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P＜0.01)，且隨著中藥劑量的增加，G1期細(xì)胞比例越高，而S期細(xì)胞比例越低，呈量效依賴性，提示中藥血清能使MC受阻于G1期，延緩細(xì)胞從G1期向S期的過(guò)渡，即抑制MC細(xì)胞周期的進(jìn)行。 第二部分補(bǔ)脾腎活血泄?jié)嶂兴帉?duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞調(diào)亡的影響 目的：觀察補(bǔ)脾腎活血泄?jié)嶂兴帉?duì)體外培養(yǎng)的大鼠腎小球MC細(xì)胞調(diào)亡的影響。

9、 方法：體外培養(yǎng)的大鼠腎小球MC系，經(jīng)低、高劑量的中藥血清處理后，分別從以下幾個(gè)方面研究中藥對(duì)大鼠腎小球MC細(xì)胞調(diào)亡的影響： 1、原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)大鼠腎小球MC細(xì)胞調(diào)亡：將待檢的細(xì)胞用原位細(xì)胞調(diào)亡試劑盒檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 2、PI單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠腎小球MC細(xì)胞的調(diào)亡率：消化收集待檢細(xì)胞，離心5分鐘，經(jīng)70％冰乙醇固定，PBS洗滌后用RNAseA37℃孵育30分鐘，PI染色30

10、分鐘，過(guò)濾上FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡率。 3、免疫印跡法(WesternBlot)檢測(cè)調(diào)亡抑制基因Bcl-2蛋白的表達(dá)：PBS漂洗待檢細(xì)胞，加入上樣緩沖液，轉(zhuǎn)移至EP管中，煮沸；取相同量的蛋白上樣進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；將SDS-聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；以20ml封閉緩沖液，加入檢測(cè)蛋白的抗體孵育；加入二抗羊抗兔IgG孵育。進(jìn)行顯色反應(yīng)，拍照。 結(jié)果： 1.TU

11、NEL法檢測(cè)分析結(jié)果顯示：藥物血清作用于大鼠腎小球MC24小時(shí)后，部分細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡，正常大鼠血清對(duì)照組上述改變不明顯。 2.PI單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析結(jié)果顯示：藥物血清作用大鼠腎小球MC24小時(shí)后，均出現(xiàn)亞二倍體細(xì)胞調(diào)亡峰。與對(duì)照組相比，調(diào)亡率隨中藥劑量增加而具有顯著性差異(P＜0.01)，提示中藥血清誘導(dǎo)腎小球MC的調(diào)亡呈量效依賴性。中藥低、高劑量組與對(duì)照組和西藥組相比有顯著性差異(P＜0.01)。 3.免疫印跡(We

12、sternBlot)檢測(cè)結(jié)果顯示：經(jīng)藥物血清作用大鼠腎小球MC24小時(shí)后，含藥血清組Bcl-2蛋白表達(dá)比正常大鼠血清對(duì)照組明顯降低。 結(jié)論： 1、補(bǔ)脾腎活血泄?jié)嶂兴幠軌蛞种拼笫竽I小球MC的過(guò)度增殖，其可能機(jī)制之一是使MC受阻于G1期，延緩細(xì)胞從G1期向S期的過(guò)渡，即通過(guò)抑制細(xì)胞周期的進(jìn)行而實(shí)現(xiàn)。 2、補(bǔ)脾腎活血泄?jié)嶂兴幠軌蛘T導(dǎo)增殖的大鼠腎小球MC調(diào)亡，其可能機(jī)制之一是通過(guò)降低抗調(diào)亡基因Bcl-2蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的