LGALS1與PRRSV2b蛋白相互作用的驗(yàn)證研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是一種單股正鏈RNA病毒，屬于尼多病毒目(Nido virales)，動(dòng)脈炎病毒科(Ateriviridae)，動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus)。PRRSV能夠引起母豬繁殖功能障礙和新生仔豬呼吸道癥狀。2b蛋白是PRRSV中較小的結(jié)構(gòu)蛋白，它可能在病毒脫殼時(shí)扮演某種離子通道的角色，與病毒感染過(guò)

2、程有關(guān)，可以促使PRRSV粒子脫殼，釋放 RNA到宿主細(xì)胞內(nèi)，但對(duì)病毒的裝配不起作用。研究2b蛋白與宿主細(xì)胞蛋白的相互作用，對(duì)全面了解 PRRSV感染機(jī)制與深入認(rèn)識(shí)2b蛋白功能具有重要意義。在前期研究中，用含有PRRSV2b基因構(gòu)建的釣餌菌株與豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM) cDNA文庫(kù)進(jìn)行酵母雙雜交，成功的篩選到了與其相互作用的凝集素-1（LGALS1）。
　　本研究成功構(gòu)建了pGADT7-LGALS1重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入Y187酵母感受

3、態(tài)中，與含有2b基因的 Y2H酵母菌株進(jìn)行了酵母回返試驗(yàn)，結(jié)果顯示在SD/-Trp-Leu-His-Ade/AbA/X-α-gal的平板上長(zhǎng)出了藍(lán)色菌落，說(shuō)明兩種蛋白間發(fā)生相互作用。在 GST-pull down試驗(yàn)中，構(gòu)建了帶有 GST標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pEGX-KG-2b和帶有His標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pET-28a-LGALS1，通過(guò)轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)BL21中進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白經(jīng)過(guò)純化后，進(jìn)行pull down試驗(yàn)，結(jié)果顯示，PRRS

4、V2b與LGALS1之間發(fā)生相互作用。在免疫共沉淀試驗(yàn)中，構(gòu)建了pCMV-HA-2b與pCMV-Myc-LGALS1真核表達(dá)重組質(zhì)粒，并將其共同轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中培養(yǎng)，使細(xì)胞在非變性條件下裂解，通過(guò)免疫共沉淀的方法驗(yàn)證了PRRSV2b與LGALS1之間發(fā)生相互作用。
　　本研究利用酵母回返試驗(yàn)、GST-pull down試驗(yàn)、免疫共沉淀試驗(yàn)三種方法成功驗(yàn)證了LGALS1與PRRSV2b蛋白間的相互作用，為研究PRRSV感染途