LGALS1與PRRSV2b蛋白相互作用的驗證研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是一種單股正鏈RNA病毒，屬于尼多病毒目(Nido virales)，動脈炎病毒科(Ateriviridae)，動脈炎病毒屬(Arterivirus)。PRRSV能夠引起母豬繁殖功能障礙和新生仔豬呼吸道癥狀。2b蛋白是PRRSV中較小的結(jié)構(gòu)蛋白，它可能在病毒脫殼時扮演某種離子通道的角色，與病毒感染過

2、程有關(guān)，可以促使PRRSV粒子脫殼，釋放 RNA到宿主細胞內(nèi)，但對病毒的裝配不起作用。研究2b蛋白與宿主細胞蛋白的相互作用，對全面了解 PRRSV感染機制與深入認識2b蛋白功能具有重要意義。在前期研究中，用含有PRRSV2b基因構(gòu)建的釣餌菌株與豬肺泡巨噬細胞(PAM) cDNA文庫進行酵母雙雜交，成功的篩選到了與其相互作用的凝集素-1（LGALS1）。
　　本研究成功構(gòu)建了pGADT7-LGALS1重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入Y187酵母感受

3、態(tài)中，與含有2b基因的 Y2H酵母菌株進行了酵母回返試驗，結(jié)果顯示在SD/-Trp-Leu-His-Ade/AbA/X-α-gal的平板上長出了藍色菌落，說明兩種蛋白間發(fā)生相互作用。在 GST-pull down試驗中，構(gòu)建了帶有 GST標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pEGX-KG-2b和帶有His標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pET-28a-LGALS1，通過轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)BL21中進行原核誘導(dǎo)表達，蛋白經(jīng)過純化后，進行pull down試驗，結(jié)果顯示，PRRS

4、V2b與LGALS1之間發(fā)生相互作用。在免疫共沉淀試驗中，構(gòu)建了pCMV-HA-2b與pCMV-Myc-LGALS1真核表達重組質(zhì)粒，并將其共同轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中培養(yǎng)，使細胞在非變性條件下裂解，通過免疫共沉淀的方法驗證了PRRSV2b與LGALS1之間發(fā)生相互作用。
　　本研究利用酵母回返試驗、GST-pull down試驗、免疫共沉淀試驗三種方法成功驗證了LGALS1與PRRSV2b蛋白間的相互作用，為研究PRRSV感染途