構建永生化的人骨髓間充質干細胞.pdf

1、目的：構建永生化的人骨髓間充質干細胞。 方法：采用陽離子脂質體介導法將病毒質粒pBabepuro-hTERT導入包裝細胞內，嘌呤霉素(Puro)篩選出病毒表達陽性的細胞克隆，測定病毒滴度。取培養(yǎng)病毒的上清液感hBMSCs細胞、篩選出轉基因細胞，我們將其命名為hTERT-hBMSCs細胞。采用端粒酶重復序列擴增(telomere repe at amplification protocol assay，TRAP)酶鏈免疫吸附試驗(

2、ELISA)法檢測hBMSCs細胞轉染前后端粒酶活性的變化；采用MTT法(四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法)測繪轉染前后細胞生長曲線，觀察hTERT轉入后對細胞增殖的影響：克隆形成實驗檢測hTERT-hBMSCs細胞的增殖能力；染色體核型分析觀察hTERT-hBMSCs細胞染色體是否正常；成骨試劑盒檢測hTERT-hBMSCs細胞向成骨分化的能力。 結果：骨髓間充質干細胞為貼壁生長的梭形細胞，表面抗原CD44表達陽性，CD34陰性

3、。TRAP-ELISA法檢測轉染hTERT的hBMSCs細胞的端粒酶為陽性，而未轉錄的正常人的hBMSCs細胞則為陰性，說明轉入hTERT基因后細胞端粒酶激活。hTERT-hBMSCs細胞比hBMSCs細胞增殖活躍，兩組相比有顯著的差異性，目前已傳了11代，尚未見衰老跡象。染色體核型分析所示：hTERT-hBMSCs細胞染色體數(shù)目和結構正常，未見缺失、斷裂、異位等畸變。成骨誘導結果表明hTERT-hBMSCs細胞仍具有向成骨分化的能力。