飛機(jī)草細(xì)胞色素P450 CYP75基因cDNA全長的克隆與鑒定.pdf

1、用異硫氰酸胍法、CTAB法和Trizol法等三種方法提取飛機(jī)草總RNA均取得較好效果，但異硫氰酸胍法最適合本實(shí)驗(yàn)使用。根據(jù)菊科植物紫莖澤蘭P450CYP75基因(AY954290)和擬南芥CYP75家族成員的核酸序列同源區(qū)設(shè)計(jì)引物，用RT-PCR方法首次從飛機(jī)草、澤蘭、佩蘭中獲得大小分別為467bp、467bp、470bp的cDNA序列，分別命名為：FJC.CYP.M；ZL.CYP.M；PL.CYP.M。同源性分析表明，3個(gè)序列同源性達(dá)

2、99％，同時(shí)與AY954290具有90％的同源性，說明它們都來自細(xì)胞色素CYP75家族。
　　 根據(jù)FJC.CYP.M核酸序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過RACE-PCR方法克隆飛機(jī)草P450基因全長。3'RACE-PCR得到309bp cDNA序列，PolyA尾巴出現(xiàn)，命名為FJC.CYP.3。5'RACE.PCR得到702bp cDNA序列，命名為FJC.CYP.5。經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它與紫莖澤蘭CYP75基因全長還差364bp，因此繼續(xù)

3、從紫莖澤蘭CYP75基因前端設(shè)計(jì)上游引物，從FJC.CYP.5核酸序列設(shè)計(jì)下游引物，進(jìn)行PCR，克隆得到一條長為384bp的cDNA序列，命名為FJC.CYP.5e。把所有飛機(jī)草細(xì)胞色素p450片段測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到長為1653bp的cDNA序列，命名為FJC.CYP.COM，推導(dǎo)編碼509個(gè)氨基酸，開放閱讀框?yàn)?1bp-1560bp，出現(xiàn)了3個(gè)經(jīng)典的細(xì)胞色素P450氨基酸保守區(qū)域，其中一個(gè)為F××G×R×C×G，起始密碼子ATG前

4、27bp處出現(xiàn)了啟動(dòng)子序列TATAbox。功能預(yù)測(cè)表明飛機(jī)草P450蛋白為一個(gè)親水性穩(wěn)定蛋白，有內(nèi)外膜共9個(gè)跨膜螺旋，定位于線粒體中。
　　 根據(jù)澤蘭、佩蘭中間片段設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行3'RACE-PCR，分別得到兩條長為340bp、625bp的cDNA片段，分別命名為ZL.CYP.3、PI.CYP.3。經(jīng)比對(duì)，初步推測(cè)ZL.CYP.3片段基因?qū)儆赑450家族里某個(gè)葉綠體束縛蛋白基因，其具體的功能還有待進(jìn)一步研究；PL.CYP.3片段