血管內皮生長因子基因轉染骨髓間充質干細胞治療缺血性心臟病的研究.pdf

1、盡管傳統(tǒng)血運重建術取得了巨大進展，但缺血性心臟病的治療仍然存在諸多不足。治療性血管生成(therapeuticangiogenesis)通常所采用的兩種方法，包括直接注射重組成血管因子的蛋白療法和基于傳遞編碼成血管因子基因的基因療法。在眾多的成血管因子中，血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)由于其在血管生成中的關鍵作用而被廣泛研究，并且VEGF還表現(xiàn)出對心肌缺血損傷的保護作用。近來

2、細胞移植促進血管生成研究是對治療性血管生成方法的有效補充。骨髓來源的間充質干細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)具有分化包括心肌細胞，內皮細胞在內的多種細胞的能力。并且，MSCs易于從骨髓中分離培養(yǎng)，體外擴增，是較為理想的種子細胞。在梗死心肌和缺血骨骼肌進行成肌細胞介導的成血管基因傳送能同時獲得肌肉生成和血管生成，因此被視為一種極具潛能的替代療法。 在這些研究的基礎上，我們假設VEGF基因轉染的MSCs移植

3、能有效增強缺血心肌的成肌和血管生成效應，進而導致心功能顯著改善。為驗證該假設，并為該方法的臨床運用進一步做出鋪墊性實驗論證，我們進行了如下研究，共分為三部分： 第一部分：VEGF真核表達質粒pcDNA3.1(-)/hVEGF165的構建及鑒定目的：構建并鑒定VEGF真核表達載體pcDNA3.1(-)/hVEGF165。 方法：運用基因重組技術，構建重組質粒pcDNA3.1(-)/hVEGF165，并對其進行酶切鑒定，DN

4、A序列測定。 結果：成功構建重組質粒pcDNA3.1(-)/hVEGF165。 第二部分：VEGF真核表達載體轉染MSCs及其表達目的：研究VEGF真核表達質粒pcDNA3.1(-)/hVEGF165體外轉染MSCs及VEGF在MSCs中的表達情況。 方法：體外分離、培養(yǎng)大鼠MSCs，對其進行表型及生長曲線測定。通過脂質體介導技術將pcDNA3.1(-)/hVEGF165轉染MSCs，Western-blot，R

5、T-PCR，ELISA及免疫細胞化學等方法檢測VEGF在MSCs中的表達情況，MTT法檢測轉染后細胞上清液中VEGF的生物活性。 結果：體外培養(yǎng)MSCs呈典型成纖維細胞樣外觀，表面分子標記物表達CD44(96±0.5％)，CD90(98.5±0.2％)，CD34(5±0.2％)和CD45(1±0.3％)。Western-blot，RT-PCR檢測轉染MSCs表達VEGF蛋白和mRNA，ELISA檢測轉染組細胞上清VEGF表達顯著

6、增加(p＜0.05)，MTT法檢測轉染組細胞上清能顯著促進人臍靜脈內皮細胞增殖(p＜0.05)，免疫細胞化學染色結果顯示轉染組VEGF陽性細胞明顯增多。 第三部分：VEGF基因轉染MSCs移植治療缺血性心臟病的研究目的：研究VEGF基因轉染的MSCs移植對缺血心肌的成肌和成血管效應。 方法：60只近交系Wistar大鼠隨機均分為以下四組：VEGF基因轉染MSCs移植組(MSCs/VEGF組)，MSCs移植組(MSCs組)

7、，pcDNA3.1(-)/hVEGF165注射組(VEGF組)，無血清培養(yǎng)基注射對照組(Control組)，結扎前降支建立急性心梗模型后在梗死區(qū)邊緣區(qū)行8×106/30μl細胞移植，VEGF組行300μg/30μl質粒注射，對照組行等量無血清培養(yǎng)基注射。細胞移植前行CM-DiI標記。移植30d后行組織化學檢測平均再生血管密度，梗死面積，移植MSCs分化情況，心臟B超、血流動力學參數(shù)測定檢測心臟功能。 結果：30d后MSCs/VE

8、GF組與MSCs組，VEGF組，Control組比較，平均再生血管密度，梗死面積，B超心臟功能測定，血流動力學參數(shù)測定均有顯著改善(p＜0.001)。移植MSCs在局部可分化為desmin(+)，cTnT(+)細胞，表現(xiàn)出心肌細胞顯型。極少數(shù)移植MSCs參與新生血管生成，新生血管成分絕大多數(shù)為宿主源性。 結論：1、成功構建重組質粒pcDNA3.1(-)/hVEGF165。 2、pcDNA3.1(-)/hVEGF165轉染

9、大鼠MSCs后能有效增加VEGF表達，并表現(xiàn)出較強的促內皮細胞增殖作用。 3、MSCs易于分離培養(yǎng)，體外擴增。 4、VEGF基因轉染MSCs移植治療能顯著促進缺血心肌新生血管再生，但只有極少數(shù)移植MSCs參與新生血管生成，新生血管成分絕大多數(shù)為宿主源性。 5、移植pcDNA3.1(-)/hVEGF165轉染的MSCs在缺血心肌可橫向分化為心肌細胞，表現(xiàn)出心肌細胞顯型，并能在一定程度上防止心室重塑。 6、V