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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:宮頸癌占婦科惡性腫瘤發(fā)病的第一位,發(fā)病率有逐年升高和發(fā)病年輕化的趨勢(shì)。隨著腫瘤學(xué)及腫瘤化學(xué)治療的基礎(chǔ)與臨床研究的迅速發(fā)展,化療在宮頸癌綜合治療中的作用日益受到重視?,F(xiàn)代研究表明,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是一條有效的腫瘤治療途徑,故尋求高效低毒的天然抗腫瘤藥物已成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。
巴豆生物堿是巴豆中主要生物活性成分的總稱。近年來,體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)巴豆生物堿能夠通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡抑制腫瘤的發(fā)生。本研究以人宮頸癌Hela細(xì)胞株為對(duì)
2、象,通過檢測(cè)用藥前后Caspase-8的表達(dá)和活性變化,探討巴豆生物堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其作用機(jī)理,從而為巴豆生物堿應(yīng)用于臨床腫瘤的輔助治療提供一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
方法:
1.細(xì)胞培育:常規(guī)復(fù)蘇凍存的Hela細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中,加入雙抗青霉素和鏈霉素(終濃度均為100U/mL),37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)松蓋培育。每?jī)商鞊Q一次液,細(xì)胞融合達(dá)80-90%時(shí),以0.25
3、%胰蛋白酶消化、傳代。
2.MTT法觀察巴豆生物堿體外抑制Hela細(xì)胞的增殖作用。
3.PI染色檢測(cè)Hela細(xì)胞周期分布情況。
4.AnnexinⅤ-PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
5.Caspase-8活性檢測(cè)。
6.RT-PCR檢測(cè)Caspase-8 mRNA的表達(dá)。
7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:細(xì)胞吸光度值(OD)和Caspase-8表達(dá)用(x)±s表達(dá),多組間比較,采用方差分析。計(jì)數(shù)資料用
4、x2檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0 for windows軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:
Hela細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察巴豆生物堿處理48h后細(xì)胞數(shù)目減少,細(xì)胞明顯皺縮,體積變小,細(xì)胞間隙增大,有凋亡小體形成。MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn),用不同濃度的巴豆生物堿處理人宮頸癌Hela細(xì)胞24、48h后,隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加,抑制率增高,表現(xiàn)為時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:空白對(duì)照組Hela細(xì)
5、胞部分細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期,而巴豆生物堿能夠阻滯Hela細(xì)胞進(jìn)入S和G2/M期,使細(xì)胞停滯于G0/G1期,各濃度的巴豆生物堿對(duì)Hela細(xì)胞凋亡率與空白組比較,48 h時(shí)間點(diǎn)明顯增高,且呈一定劑量依賴關(guān)系。經(jīng)巴豆生物堿作用48小時(shí)后,Hela細(xì)胞Caspase-8活性明顯增加。而RT-PCR檢測(cè)經(jīng)巴豆生物堿作用12小時(shí)后, Caspase-8 mRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物與β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶的吸光度比值明顯升高。
結(jié)論
6、:
1.巴豆生物堿對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用,且隨時(shí)間和劑量增加抑制率明顯上升。
2.巴豆生物堿能夠通過抗有絲分裂、誘導(dǎo)凋亡途徑抑制Hela細(xì)胞增殖。
3.巴豆生物堿可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)宮頸癌Hela細(xì)胞株Caspase-8mRNA的表達(dá),亦可激活Caspase-8的活性,提示通過作用于caspase-8的表達(dá),循半胱氨酸蛋白酶(caspase)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是巴豆生物堿促凋亡的另一機(jī)制。
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