巴豆生物堿體外誘導(dǎo)人宮頸癌細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、目的：宮頸癌占婦科惡性腫瘤發(fā)病的第一位，發(fā)病率有逐年升高和發(fā)病年輕化的趨勢。隨著腫瘤學(xué)及腫瘤化學(xué)治療的基礎(chǔ)與臨床研究的迅速發(fā)展，化療在宮頸癌綜合治療中的作用日益受到重視。現(xiàn)代研究表明，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是一條有效的腫瘤治療途徑，故尋求高效低毒的天然抗腫瘤藥物已成為腫瘤治療的研究熱點。
　　巴豆生物堿是巴豆中主要生物活性成分的總稱。近年來，體外實驗證實巴豆生物堿能夠通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡抑制腫瘤的發(fā)生。本研究以人宮頸癌Hela細胞株為對

2、象，通過檢測用藥前后Caspase-8的表達和活性變化，探討巴豆生物堿對宮頸癌細胞生長的影響及其作用機理，從而為巴豆生物堿應(yīng)用于臨床腫瘤的輔助治療提供一定的實驗室依據(jù)。
　　方法：
　　1.細胞培育:常規(guī)復(fù)蘇凍存的Hela細胞懸浮培養(yǎng)于含10％胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，加入雙抗青霉素和鏈霉素(終濃度均為100U/mL)，37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)松蓋培育。每兩天換一次液，細胞融合達80-90％時，以0.25

3、％胰蛋白酶消化、傳代。
　　2.MTT法觀察巴豆生物堿體外抑制Hela細胞的增殖作用。
　　3.PI染色檢測Hela細胞周期分布情況。
　　4.AnnexinⅤ-PI染色檢測細胞凋亡。
　　5.Caspase-8活性檢測。
　　6.RT-PCR檢測Caspase-8 mRNA的表達。
　　7.統(tǒng)計學(xué)方法:細胞吸光度值(OD)和Caspase-8表達用(x)±s表達，多組間比較，采用方差分析。計數(shù)資料用

4、x2檢驗。所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0 for windows軟件包進行統(tǒng)計。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　Hela細胞的形態(tài)學(xué)觀察巴豆生物堿處理48h后細胞數(shù)目減少，細胞明顯皺縮，體積變小，細胞間隙增大，有凋亡小體形成。MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用不同濃度的巴豆生物堿處理人宮頸癌Hela細胞24、48h后，隨著藥物濃度和作用時間的增加，抑制率增高，表現(xiàn)為時間和劑量依賴關(guān)系。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示:空白對照組Hela細

5、胞部分細胞進入S期和G2/M期，而巴豆生物堿能夠阻滯Hela細胞進入S和G2/M期，使細胞停滯于G0/G1期，各濃度的巴豆生物堿對Hela細胞凋亡率與空白組比較，48 h時間點明顯增高，且呈一定劑量依賴關(guān)系。經(jīng)巴豆生物堿作用48小時后，Hela細胞Caspase-8活性明顯增加。而RT-PCR檢測經(jīng)巴豆生物堿作用12小時后， Caspase-8 mRNA基因擴增產(chǎn)物與β-actin基因擴增產(chǎn)物電泳帶的吸光度比值明顯升高。
　　結(jié)論

6、：
　　1.巴豆生物堿對宮頸癌Hela細胞的生長有明顯的抑制作用，且隨時間和劑量增加抑制率明顯上升。
　　2.巴豆生物堿能夠通過抗有絲分裂、誘導(dǎo)凋亡途徑抑制Hela細胞增殖。
　　3.巴豆生物堿可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)宮頸癌Hela細胞株Caspase-8mRNA的表達，亦可激活Caspase-8的活性，提示通過作用于caspase-8的表達，循半胱氨酸蛋白酶(caspase)通路誘導(dǎo)細胞凋亡是巴豆生物堿促凋亡的另一機制。