JAB1對糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄活性及功能調(diào)控的實驗研究.pdf

1、糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids，GC)是臨床上常用抗炎、抗免疫反應藥物，普遍認為GC的抗炎效應是通過糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoidreceptor，GR)調(diào)控多種炎性因子的表達。以往的研究表明嚴重創(chuàng)傷后多種器官組織GR表達減少，尤其是GR核轉(zhuǎn)位減少，提示GR的轉(zhuǎn)錄激活能力減弱，但其具體的分子機制尚不清楚。激活的GR也可直接與其它轉(zhuǎn)錄因子相互作用，如核因子-κB(nuclearfactorκB，NF-κB)和活化

2、蛋白-1(activatorprotein-1，AP-1)，AP-1和NF-κB是調(diào)控炎性基因表達的重要轉(zhuǎn)錄因子，GR與轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用可能通過它們共同的輔活化因子來介導。c-Jun激活區(qū)結(jié)合蛋白1(c-Junactivationdomain-bindingproteinl，JAB1)是一種多功能蛋白質(zhì)，能與多種蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，調(diào)控多種細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路。JAB1也能增強多種轉(zhuǎn)錄因子的活性如核受體、AP-1和NF-κB。以往的

3、研究表明JAB1能與GR-LBD在COS-7細胞中特異性地發(fā)生相互作用，因此，JAB1均能與GR、AP-1和NF-κB發(fā)生相互作用，提示JAB1可能在炎癥反應的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但JAB1對GR的具體作用目前仍不清楚。 本研究的目的是為了進一步明確JAB1對GR轉(zhuǎn)錄活性及功能的調(diào)控作用及JAB1和GR在創(chuàng)傷后應激反應紊亂中的作用，闡明安定-氯胺酮對嚴重燒傷早期應激和炎癥反應的調(diào)控作用及分子機制，為調(diào)控嚴重創(chuàng)傷后早期應激反應紊

4、亂提供新的途徑。本研究首先應用JAB1、hGRα表達質(zhì)粒與GRE-CAT報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-7細胞，通過CATELISA方法觀察JAB1及LPS對GR轉(zhuǎn)錄激活活性的影響。其次通過電穿孔方法將JAB1表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞，觀察JAB1高表達對GR表達水平及功能的影響，并同時觀察對RAW264.7細胞分泌致炎細胞因子TNF-α及IL-6的影響。最后以嚴重燒傷小鼠為創(chuàng)傷動物實驗模型，旨在觀察燒傷后早期肝臟、肺及腹腔

5、巨噬細胞中JAB1、GR的變化特點及相互關(guān)系以及安定-氯胺酮對其影響，進一步明確JAB1、GR在嚴重創(chuàng)傷早期的相互關(guān)系。 主要實驗結(jié)果：1.采用脂質(zhì)體法將pCDNA3.1-JAB1、pCMV-hGRα和pMAMneo-CATGRE報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-7細胞36h后，通過ELISA方法檢測CAT濃度發(fā)現(xiàn)隨著pCDNA3.1-JAB1質(zhì)粒劑量的增加，CAT濃度也逐漸上升，而且均顯著高于未轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-JAB1質(zhì)粒組。提示J

6、AB1能增強GR的轉(zhuǎn)錄激活活性且呈劑量依賴性。 2.與對照組相比，LPS能顯著地降低CAT濃度，但共轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-JAB1質(zhì)?？赡孓D(zhuǎn)CAT活性的降低。提示LPS能抑制GR的轉(zhuǎn)錄激活活性，高表達JAB1能緩解LPS對GR轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用。 3.給予LPS、地塞米松刺激小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7細胞發(fā)現(xiàn)，100nM地塞米松對JAB1mRNA表達水平無明顯影響，但可顯著下調(diào)JAB1蛋白表達水平，并且對RAW2

7、64.7細胞GR表達有顯著下調(diào)作用。LPS能下調(diào)JAB1mRNA及蛋白表達水平，但對GR蛋白表達水平則表現(xiàn)為上調(diào)作用。同時發(fā)現(xiàn)LPS刺激RAW264.7細胞分泌致炎細胞因子TNF-α、IL-6較對照組顯著增加，而且在刺激24h后仍持續(xù)增高，說明LPS是誘導巨噬細胞分泌致炎細胞因子的強效誘導劑。 4.利用電穿孔方法將pFLAG-CMV2-JAB1真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入RAW264.7細胞，轉(zhuǎn)染36h后，應用RT-PCR及Western

8、blot方法檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JAB1mRNA及蛋白的表達水平均較未轉(zhuǎn)染對照組顯著增加，同時發(fā)現(xiàn)GR蛋白表達水平也顯著增加，提示JAB1高表達能提高RAW264.7細胞GR的表達水平。應用LPS、地塞米松刺激轉(zhuǎn)染JAB1基因的RAW264.7細胞發(fā)現(xiàn)，JAB1高表達能緩解地塞米松對RAW264.7細胞GR表達的抑制作用，并且發(fā)現(xiàn)JAB1高表達能顯著降低LPS誘導RAW264.7細胞分泌致炎細胞因子TNF-α和IL-6的能力。提示JAB1高表

9、達可增加GR的表達水平及轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制LPS誘導的巨噬細胞合成與分泌致炎細胞因子，對LPS誘發(fā)的炎癥反應有抑制作用。 5.應用RT-PCR及Westernbolt方法發(fā)現(xiàn)小鼠嚴重燒傷后肝臟、肺及腹腔巨噬細胞GR的表達水平均存在不同程度的明顯下調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)JAB1mRNA及蛋白水平也存在不同程度的下調(diào)，而且GR與JAB1的下調(diào)趨勢基本相似。這提示GR在嚴重燒傷后表達下調(diào)可能與JAB1的表達降低有關(guān)。而且發(fā)現(xiàn)應用安定-氯胺酮也能

10、對小鼠肝臟、肺及腹腔巨噬細胞GR、JAB1的表達產(chǎn)生不同程度的抑制作用。但在嚴重燒傷后應用安定-氯胺酮則發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟、肺及腹腔巨噬細胞GR、JAB1表達水平與正常對照組無顯著性差異，故提示嚴重燒傷后應用安定-氯胺酮能明顯抑制嚴重燒傷對GR、JAB1表達水平的下調(diào)作用，主要結(jié)論：1.在GC存在下，高表達JAB1能增強GR的轉(zhuǎn)錄激活活性，并且呈劑量依賴性。 2.LPS能抑制GR的轉(zhuǎn)錄激活活性，而且高表達JAB1能部分逆轉(zhuǎn)LPS對GR

11、轉(zhuǎn)錄激活活性的抑制作用。 3.LPS能顯著地引起RAW264.7巨噬細胞JAB1mRNA和蛋白表達水平下調(diào)，地塞米松也可顯著地降低JAB1蛋白表達，但對其mRNA表達則無明顯影響。 4.地塞米松能顯著地下調(diào)GR表達，而LPS則增強GR蛋白表達水平。 5.小鼠RAW264.7巨噬細胞高表達JAB1能顯著地增加GR的表達水平，也能抑制LPS誘發(fā)的致炎細胞因子生成。這提示LPS刺激的RAW264.7細胞，高表達JAB1