JAB1對(duì)糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄活性及功能調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids，GC)是臨床上常用抗炎、抗免疫反應(yīng)藥物，普遍認(rèn)為GC的抗炎效應(yīng)是通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoidreceptor，GR)調(diào)控多種炎性因子的表達(dá)。以往的研究表明嚴(yán)重創(chuàng)傷后多種器官組織GR表達(dá)減少，尤其是GR核轉(zhuǎn)位減少，提示GR的轉(zhuǎn)錄激活能力減弱，但其具體的分子機(jī)制尚不清楚。激活的GR也可直接與其它轉(zhuǎn)錄因子相互作用，如核因子-κB(nuclearfactorκB，NF-κB)和活化

2、蛋白-1(activatorprotein-1，AP-1)，AP-1和NF-κB是調(diào)控炎性基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，GR與轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用可能通過(guò)它們共同的輔活化因子來(lái)介導(dǎo)。c-Jun激活區(qū)結(jié)合蛋白1(c-Junactivationdomain-bindingproteinl，JAB1)是一種多功能蛋白質(zhì)，能與多種蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，調(diào)控多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。JAB1也能增強(qiáng)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性如核受體、AP-1和NF-κB。以往的

3、研究表明JAB1能與GR-LBD在COS-7細(xì)胞中特異性地發(fā)生相互作用，因此，JAB1均能與GR、AP-1和NF-κB發(fā)生相互作用，提示JAB1可能在炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但JAB1對(duì)GR的具體作用目前仍不清楚。 本研究的目的是為了進(jìn)一步明確JAB1對(duì)GR轉(zhuǎn)錄活性及功能的調(diào)控作用及JAB1和GR在創(chuàng)傷后應(yīng)激反應(yīng)紊亂中的作用，闡明安定-氯胺酮對(duì)嚴(yán)重?zé)齻缙趹?yīng)激和炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用及分子機(jī)制，為調(diào)控嚴(yán)重創(chuàng)傷后早期應(yīng)激反應(yīng)紊

4、亂提供新的途徑。本研究首先應(yīng)用JAB1、hGRα表達(dá)質(zhì)粒與GRE-CAT報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，通過(guò)CATELISA方法觀(guān)察JAB1及LPS對(duì)GR轉(zhuǎn)錄激活活性的影響。其次通過(guò)電穿孔方法將JAB1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，觀(guān)察JAB1高表達(dá)對(duì)GR表達(dá)水平及功能的影響，并同時(shí)觀(guān)察對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌致炎細(xì)胞因子TNF-α及IL-6的影響。最后以嚴(yán)重?zé)齻∈鬄閯?chuàng)傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停荚谟^(guān)察燒傷后早期肝臟、肺及腹腔

5、巨噬細(xì)胞中JAB1、GR的變化特點(diǎn)及相互關(guān)系以及安定-氯胺酮對(duì)其影響，進(jìn)一步明確JAB1、GR在嚴(yán)重創(chuàng)傷早期的相互關(guān)系。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.采用脂質(zhì)體法將pCDNA3.1-JAB1、pCMV-hGRα和pMAMneo-CATGRE報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞36h后，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)CAT濃度發(fā)現(xiàn)隨著pCDNA3.1-JAB1質(zhì)粒劑量的增加，CAT濃度也逐漸上升，而且均顯著高于未轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-JAB1質(zhì)粒組。提示J

6、AB1能增強(qiáng)GR的轉(zhuǎn)錄激活活性且呈劑量依賴(lài)性。 2.與對(duì)照組相比，LPS能顯著地降低CAT濃度，但共轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-JAB1質(zhì)?？赡孓D(zhuǎn)CAT活性的降低。提示LPS能抑制GR的轉(zhuǎn)錄激活活性，高表達(dá)JAB1能緩解LPS對(duì)GR轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用。 3.給予LPS、地塞米松刺激小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，100nM地塞米松對(duì)JAB1mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯影響，但可顯著下調(diào)JAB1蛋白表達(dá)水平，并且對(duì)RAW2

7、64.7細(xì)胞GR表達(dá)有顯著下調(diào)作用。LPS能下調(diào)JAB1mRNA及蛋白表達(dá)水平，但對(duì)GR蛋白表達(dá)水平則表現(xiàn)為上調(diào)作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌致炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6較對(duì)照組顯著增加，而且在刺激24h后仍持續(xù)增高，說(shuō)明LPS是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌致炎細(xì)胞因子的強(qiáng)效誘導(dǎo)劑。 4.利用電穿孔方法將pFLAG-CMV2-JAB1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36h后，應(yīng)用RT-PCR及Western

8、blot方法檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JAB1mRNA及蛋白的表達(dá)水平均較未轉(zhuǎn)染對(duì)照組顯著增加，同時(shí)發(fā)現(xiàn)GR蛋白表達(dá)水平也顯著增加，提示JAB1高表達(dá)能提高RAW264.7細(xì)胞GR的表達(dá)水平。應(yīng)用LPS、地塞米松刺激轉(zhuǎn)染JAB1基因的RAW264.7細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，JAB1高表達(dá)能緩解地塞米松對(duì)RAW264.7細(xì)胞GR表達(dá)的抑制作用，并且發(fā)現(xiàn)JAB1高表達(dá)能顯著降低LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌致炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的能力。提示JAB1高表

9、達(dá)可增加GR的表達(dá)水平及轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞合成與分泌致炎細(xì)胞因子，對(duì)LPS誘發(fā)的炎癥反應(yīng)有抑制作用。 5.應(yīng)用RT-PCR及Westernbolt方法發(fā)現(xiàn)小鼠嚴(yán)重?zé)齻蟾闻K、肺及腹腔巨噬細(xì)胞GR的表達(dá)水平均存在不同程度的明顯下調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)JAB1mRNA及蛋白水平也存在不同程度的下調(diào)，而且GR與JAB1的下調(diào)趨勢(shì)基本相似。這提示GR在嚴(yán)重?zé)齻蟊磉_(dá)下調(diào)可能與JAB1的表達(dá)降低有關(guān)。而且發(fā)現(xiàn)應(yīng)用安定-氯胺酮也能

10、對(duì)小鼠肝臟、肺及腹腔巨噬細(xì)胞GR、JAB1的表達(dá)產(chǎn)生不同程度的抑制作用。但在嚴(yán)重?zé)齻髴?yīng)用安定-氯胺酮?jiǎng)t發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟、肺及腹腔巨噬細(xì)胞GR、JAB1表達(dá)水平與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異，故提示嚴(yán)重?zé)齻髴?yīng)用安定-氯胺酮能明顯抑制嚴(yán)重?zé)齻麑?duì)GR、JAB1表達(dá)水平的下調(diào)作用，主要結(jié)論：1.在GC存在下，高表達(dá)JAB1能增強(qiáng)GR的轉(zhuǎn)錄激活活性，并且呈劑量依賴(lài)性。 2.LPS能抑制GR的轉(zhuǎn)錄激活活性，而且高表達(dá)JAB1能部分逆轉(zhuǎn)LPS對(duì)GR

11、轉(zhuǎn)錄激活活性的抑制作用。 3.LPS能顯著地引起RAW264.7巨噬細(xì)胞JAB1mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)，地塞米松也可顯著地降低JAB1蛋白表達(dá)，但對(duì)其mRNA表達(dá)則無(wú)明顯影響。 4.地塞米松能顯著地下調(diào)GR表達(dá)，而LPS則增強(qiáng)GR蛋白表達(dá)水平。 5.小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞高表達(dá)JAB1能顯著地增加GR的表達(dá)水平，也能抑制LPS誘發(fā)的致炎細(xì)胞因子生成。這提示LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞，高表達(dá)JAB1