雞MDA5信號(hào)通路在IBDV致雛雞法氏囊病理?yè)p傷中的作用研究.pdf

1、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)為dsRNA病毒，可造成感染雛雞法氏囊損傷而導(dǎo)致雛雞發(fā)生免疫抑制。本試驗(yàn)以14日齡SPF雛雞為研究對(duì)象，從特異性識(shí)別dsRNA病毒的模式識(shí)別受體MDA5入手，應(yīng)用分子生物學(xué)以及組織病理學(xué)檢測(cè)技術(shù)對(duì)IBDV感染雛雞法氏囊內(nèi)chMDA5及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號(hào)分子的表達(dá)、IBDV含量及法氏囊病理形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行研究，以其明確chMDA5信號(hào)通路在IBDV感染雛雞法氏囊損傷機(jī)制中的作用。
　　首先，提取IBDV感

2、染雛雞法氏囊總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR方法克隆出IBDV VP2全長(zhǎng)基因片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-VP2，通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)得到蛋白并進(jìn)行純化，制備兔抗IBDV VP2多克隆抗體，經(jīng)ELISA、Western blot及間接免疫熒光方法鑒定，此多抗具有較好的特異性和反應(yīng)性。
　　之后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、間接免疫熒光技術(shù)及傳統(tǒng)病理學(xué)技術(shù)對(duì)IBDV標(biāo)準(zhǔn)株及IBD中等毒力活疫苗感染/免疫雛雞法氏

3、囊內(nèi)IBDV含量及其病理形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩試驗(yàn)組雛雞法氏囊內(nèi)IBDV含量及其VP2蛋白表達(dá)趨勢(shì)均較一致，均從感染后1d大量表達(dá)，至感染后4d達(dá)到峰值(P＜0.01)，隨后開始下調(diào)，感染組至感染后35 d接近對(duì)照水平，疫苗組至免疫后21d接近對(duì)照水平。雛雞感染IBDV標(biāo)準(zhǔn)株后1-7 d，法氏囊眼觀病理變化為不同程度的萎縮，有黃色膠凍樣物質(zhì)滲出，內(nèi)部充滿黏液以及出血現(xiàn)象，感染后21、35 d法氏囊僅表現(xiàn)為萎縮;免疫IBD中等毒

4、力活疫苗后僅見法氏囊輕微萎縮并在后期逐漸恢復(fù)。雛雞感染IBDV標(biāo)準(zhǔn)株后1-7 d其病理組織學(xué)變化表現(xiàn)為急性炎癥變化，即大量淋巴細(xì)胞壞死、崩解，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，網(wǎng)狀細(xì)胞數(shù)量增多，充血或出血，間質(zhì)結(jié)締組織增生，感染后35 d其淋巴濾泡面積仍小于對(duì)照雛雞;免疫IBD中等毒力活疫苗后，上述病理變化均輕微，且至免疫后21 d基本恢復(fù)正常水平。
　　同時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、間接免疫熒光技術(shù)對(duì)雛雞法氏囊內(nèi)chMDA5及其信號(hào)轉(zhuǎn)

5、導(dǎo)通路銜接蛋白分子(chIPS-1)、轉(zhuǎn)錄因子(chIRF3、chNF-κB)、誘導(dǎo)產(chǎn)物即細(xì)胞因子（chIFN-β、chTNF-α、chIL-1β和chIL-6）的表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染IBDV標(biāo)準(zhǔn)株雛雞法氏囊內(nèi)chMDA5 mRNA與蛋白表達(dá)、chIPS-1、chIRF3、chNF-κB、chIFN-β、chTNF-α、chIL-1β和chIL-6mRNA表達(dá)量均從感染后1d開始明顯升高，至感染后4d達(dá)到峰值（P＜0.01）

6、，隨后開始下調(diào)，之后逐漸恢復(fù)正常水平。免疫IBD中等毒力活疫苗雛雞法氏囊內(nèi)上述分子表達(dá)規(guī)律與感染組基本一致，但上調(diào)水平均低于感染組。
　　上述結(jié)果表明，IBDV能夠激活雛雞法氏囊內(nèi)chMDA5信號(hào)通路，參與IBDV感染雛雞過(guò)程，且chMDA5信號(hào)通路活化程度與IBDV毒力正相關(guān);IBDV激活雛雞法氏囊內(nèi)chMDA5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子的釋放，導(dǎo)致法氏囊組織發(fā)生損傷，并且其損傷程度與chMDA5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化程度相關(guān)。