Raf-Erk1-2-Merk信號(hào)傳導(dǎo)通路在脊髓損傷修復(fù)中的病理機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究發(fā)現(xiàn)Raf/Erk1/2/Merk信號(hào)傳導(dǎo)通路控制著很多細(xì)胞的反應(yīng)，對(duì)體內(nèi)外的細(xì)胞的凋亡有很重要的作用。為研究Raf/Erk1/2/Merk信號(hào)傳導(dǎo)通路在脊髓損傷后的病理機(jī)制，①通過培養(yǎng)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞和脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞，構(gòu)建脊髓損傷的體外細(xì)胞模型，對(duì)該信號(hào)通路的機(jī)制進(jìn)行探索。②建立脊髓損傷的動(dòng)物模型，應(yīng)用Raf/Erk1/2/Merk信號(hào)通路抑制劑，觀察小鼠脊髓損傷后功能恢復(fù)和軸突再生，探討Raf/Erk1/2/Merk信號(hào)

2、通路對(duì)動(dòng)物模型脊髓損傷后神經(jīng)再生的作用機(jī)制。
　　 方法：從新生1天的C57BL/6J胎鼠脊髓內(nèi)分離培養(yǎng)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，利用腺病毒攜帶綠色熒光蛋白(Ad-GFP)和腺病毒攜帶Raf-1蛋白(Ad-Raf1)感染脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察細(xì)胞粘附和遷移能力的變化，通過免疫組化、Western-blot、RT-PCR和細(xì)胞電生理技術(shù)(patch-clamp)觀察Raf/Erk1/2/Merk信號(hào)通路上調(diào)后對(duì)脊髓

3、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育的影響。并將基因轉(zhuǎn)染后的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察Raf/Erk1/2/Merk信號(hào)通路上調(diào)后兩種細(xì)胞之間的相互作用。利用NYU Impactor-Ⅱ打擊器制作成年C57BL/6J小鼠胸10(T10)脊髓損傷模型（打擊重量和高度為:10g×5mm）。利用Raf/Erk1/2/Merk信號(hào)通路抑制劑U0126，觀察Raf/Erk1/2/Merk信號(hào)通路抑制后對(duì)脊髓損傷神經(jīng)修復(fù)的作用，將60只大鼠

4、隨機(jī)分成3組:A組:非手術(shù)組（注射DMSO）;B組:脊髓損傷組(注射DMSO);C組:脊髓損傷組（注射U0126組）。術(shù)后采用BMS評(píng)分和Rotard試驗(yàn)對(duì)動(dòng)物后肢功能恢復(fù)情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。利用免疫組化、BDA、Western-blot和膜片鉗技術(shù)(Patch-clamp)觀察動(dòng)物損傷后的神經(jīng)再生變化。綜合以上數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：①成功分離和純化了脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞，并上調(diào)了細(xì)胞內(nèi)Raf/Erk1/2/

5、Merk的信號(hào)水平。升高的Raf/Erk1/2/Merk信號(hào)水平促進(jìn)了脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的遷移能力，但是阻礙了脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞的突觸形成，抑制了脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞的樹突向成熟分化的能力。但是隨著Raf/ERK/Merk信號(hào)水平的升高，本研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞在體外發(fā)育明顯增強(qiáng)，促進(jìn)了星形膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育和成熟。與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)72h后，脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元突觸標(biāo)志物增加并出現(xiàn)成簇現(xiàn)象，軸突和樹突也進(jìn)一步分化，突觸的數(shù)目較對(duì)照組增加了7倍

6、(p＜0.001)。②在動(dòng)物體模型內(nèi)，U0126組動(dòng)物神經(jīng)功能恢復(fù)明顯好于對(duì)照組，兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。免疫組化及BDA染色結(jié)果顯示U0126組有較多的再生神經(jīng)纖維通過損傷區(qū)，而脊髓損傷組和非手術(shù)組幾乎未見再生神經(jīng)纖維穿越。免疫組化染色顯示U0126組損傷空洞明顯小于其余兩組(p＜0.05)。電生理學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，U0126組潛伏期延長(p＜0.05)，動(dòng)作電位幅度增高(p＜0.05)，長時(shí)程動(dòng)作電位明顯增加(

7、P＜0.01)。
　　 結(jié)論：Raf/Erk1/2/Merk信號(hào)傳導(dǎo)水平的升高會(huì)損傷脊髓神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育并造成神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)的不平衡，相反，信號(hào)水平的升高會(huì)刺激膠質(zhì)細(xì)胞增生并分泌多種神經(jīng)誘導(dǎo)因子，促進(jìn)共培養(yǎng)早期脊髓神經(jīng)細(xì)胞的成熟，從而為臨床治療脊髓損傷黃金治療時(shí)間點(diǎn)的選擇提供了理論依據(jù)。抑制該信號(hào)傳導(dǎo)通路可以促進(jìn)脊髓損傷動(dòng)物的功能恢復(fù)、軸突再生以及電生理學(xué)改善，以上結(jié)果證明了Raf/Erk1/2/Merk信號(hào)通路在脊髓損傷的修復(fù)過程