華貴櫛孔扇貝三個抗氧化相關(guān)基因的克隆及其在急性低溫脅迫下的表達(dá)特性.pdf

1、華貴櫛孔扇貝是我國南方沿海的重要海水養(yǎng)殖貝類之一,具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。這種扇貝不但貝殼具有橙色、橙紫色、紫色、褐色等多種絢麗的色彩,而且閉殼肌、外套膜等肌肉也有橙色與白色之分。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),橙色個體(貝殼、外套膜、閉殼肌都是橙色)各組織中的類胡蘿卜素含量均顯著高于褐色個體(貝殼褐色、外套膜與閉殼肌均為白色),并且前者比后者具有更高的抗氧化能力。
　　在生物系統(tǒng)進(jìn)化過程中,動物細(xì)胞為了保護(hù)自身免受損傷,形成了一套由抗氧化酶體系

2、(如超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT、谷胱甘肽過氧化氫酶GPX等)和抗氧化非酶體系(如類胡蘿卜素、輔酶Q、硒、維生素、含巰基化合物等)組成的抗氧化防御體系,以維持體內(nèi)ROS的動態(tài)平衡,起到抗氧化的作用。SOD在清除活性氧反應(yīng)過程中第一個發(fā)揮作用,它將超氧陰離子自由基快速歧化為過氧化氫和分子氧;過氧化氫在CAT和GPX的作用下轉(zhuǎn)化為水和分子氧。因此,本文選CuZnSOD、MnSOD、CAT作為抗氧化的研究對象。
　　本文以課題

3、組建立的華貴櫛孔扇貝橙色品系和褐色品系為材料,采用36h的急性低溫脅迫后,獲得二者的外套膜、鰓、卵巢、血液等組織樣品。然后克隆了CnCuZnSOD、CnMnSOD、CnCAT等三個基因的全長cDNA,并進(jìn)行了同源性分析、時空表達(dá)分析,測定和比較脅迫組與對照組樣品的總類胡蘿卜素含量(TotalCarotenoidsContent,TCC)以及抗氧化相關(guān)酶活性等指標(biāo),從分子水平上探討急性低溫脅迫下橙、褐色兩個品系中類胡蘿卜素含量與其抗氧化防

4、御之間的相關(guān)性。主要結(jié)果如下:
　　1、三個抗氧化基因全長cDNA序列的克隆。首先從本課題組454測序數(shù)據(jù)庫中獲得CnCuZnSOD、CnMnSOD以及CnCAT基因的部分cDNA序列,然后利用RACE-PCR以及通過序列拼接獲得它們的全長cDNA。CnCuZnSOD基因為1078bp,共編碼154個氨基酸殘基;CnMnSOD基因全長序為1047bp,共編碼226個氨基酸殘基;CnCAT基因為1851bp,共編碼522個氨基酸殘基

5、。同源分析發(fā)現(xiàn),這三個基因與櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)、蝦夷扇貝(Mizuhopectenyessoensis)以及海灣扇貝(Argopectenirradians)顯示出更近的親緣關(guān)系,它們先匯成一支后,之后依次與其它海洋貝類、昆蟲、蝦、蟹等節(jié)肢動物聚類,最后與脊椎動物聚類。
　　2、比較了三個基因在橙、褐色兩個品系間的時空表達(dá)。采用real-timePCR方法對橙色與褐色品系各組織中CnCuZnSOD、CnMnS

6、OD以及CnCATmRNA絕對含量及對急性低溫脅迫下各組織中三個基因相對含量進(jìn)行檢測。三個抗氧化基因均在鰓中表達(dá)水平最高,而在別的組織間表達(dá)水平就有所差異。急性低溫脅迫下,三個基因的表達(dá)量在橙、褐色兩個品系扇貝的血液、鰓和外套膜上均出現(xiàn)了一種先升后降然后再升最后降至最低的變化趨勢,并且多數(shù)情況下在橙色品系組織中的表達(dá)量高于褐色品系組織的表達(dá)量。
　　3、急性低溫脅迫下,TCC、SOD和CAT酶活性的變化情況。急性低溫脅迫下,橙色品

7、系TCC顯著高于褐色品系,也誘發(fā)SOD、CAT酶活性發(fā)生顯著變化。本研究顯示,在急性低溫脅迫下,SOD活性表現(xiàn)為先降后升再降的變化趨勢,橙、褐色兩個品系的CAT比活力均經(jīng)歷了先大幅度地增高然后下降的變化,而且多數(shù)情況下橙色品系比褐色品系具有更高的SOD與CAT酶活力含量。
　　4、抗氧化基因表達(dá)量、類胡蘿卜素含量和抗氧化相關(guān)酶活力之間的關(guān)系。在華貴櫛孔扇貝橙色品系各組織中,CnCuZnSOD和CnMnSOD基因表達(dá)水平、TCC和S

8、OD兩兩之間均存在顯著的正相關(guān)(P<0.05),CnCAT表達(dá)水平、TCC以及CAT兩兩之間也存在顯著的正相關(guān)(P<0.05);而在褐色品系中只有鰓組織中的CnCAT表達(dá)水平與CAT存在顯著的正相關(guān)(P<0.05)。
　　本研究首次獲得華貴櫛孔扇貝三個抗氧化相關(guān)基因全長cDNA序列,并利用富含類胡蘿卜素的品系首次系統(tǒng)地開展貝類低溫生物學(xué)理論研究,給低溫環(huán)境下抗氧化機(jī)制的研究提供了新角度。本研究豐富貝類抗氧化防御的研究理論,既可彌補(bǔ)