小鼠GV期卵母細胞的研究——核質比、ATP8表達及其RNAi載體構建.pdf

1、目的：1、分析小鼠卵巢生發(fā)泡(germinal vesicle，GV)期卵母細胞的核質比，探討核質比在卵母細胞成熟發(fā)育中的作用；2、分析GV期卵母細胞線粒體ATP合酶亞基8(ATP8)的表達及其生物信息學數(shù)據(jù)，研究卵母細胞成熟與線粒體功能的關系；3、構建ATP8基因的RNA干擾載體，為研究ATP8基因在卵母細胞成熟發(fā)育過程中的作用及其對卵母細胞發(fā)育參數(shù)-核質比的調控奠定基礎。 方法：1、用擠壓法從卵巢中分離獲得GV期卵母細胞并置

2、leica Mps 60倒置顯微鏡下拍照，測量系統(tǒng)經(jīng)標準圖片校正后，測量GV期卵母細胞面積和半徑，按核質比(nucleus-plasma ratio，NP)公式：NP=V<,N>/(V<,c>-V<,N>)，式中V<,N>為核的體積，V<,c>為細胞的體積，由V=4/3pr<'3>分別求得，計算出GV期卵母細胞的核質比；2、以Genbank(NC 005089)公布的線粒體ATP8序列為參考，設計兩對引物，用RT-PCR檢測GV期單個卵

3、母細胞中ATP8基因的表達：其中，cDNA的合成分兩種方法進行：一是將GV期單個卵母細胞直接進行RT合成cDNA，二是先用DNA酶加EcoR Ⅰ酶祛除mtDNA和核DNA后再進行RT；回收產(chǎn)物構建克隆質粒并測序；3、用Blastn、VECTOR NIT 9.0、RNAdraw、 Treeview等工具對測序結果進行生物信息學分析，在此基礎上用RNA聚合酶Ⅲ啟動子表達siRNA法構建ATP8的RNA干擾載體。 結果：1、分離獲得G

4、V期卵母細胞51枚，測得卵徑為40.940±3.341 μm，核徑為15.020±2.236μm，其核質比為0.054±0.019；2、RT-PCR結果顯示ATP8基因在GV期卵母細胞中表達。克隆測序顯示所測昆明小鼠ATP8序列與Genbank序列完全一致；3、blastp序列比對和mRNA二級結構圖均顯示12種動物間的ATP8氨基酸序列和ATP8核酸序列有較大差異，其中不同品種小鼠問也有差異；4、不同物種ATP8核苷酸序列構建出的分子

5、進化樹中，小鼠與棕熊進化距離較遠，與田鼠、家貓進化距離相對較近。5、設計ATP8基因干擾序列并且重組質粒經(jīng)過限制性內切酶和測序鑒定，表明成功構建了pGPH1/GFP/Neo-mouse-shATP8 RNA干擾質粒。 結論：1、本文測得小鼠GV期卵母細胞的核質比為0.054±0.019，與文獻報道其它物種同時相核質比在相同范圍內，提示核質比是卵母細胞發(fā)育成熟的重要指標；2、線粒體ATP8基因在GV期卵母細胞中有表達，提示Gv期卵