Ang-(1-7)對(duì)子癇前期足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下兩部分展開了論述：
　　第一部分 Ang-(1-7)對(duì)子癇前期足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　目的:
　　近年來腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在子癇前期腎臟損傷中的作用被逐漸認(rèn)識(shí)。Ang-(1-7)是RAS系統(tǒng)一個(gè)重要的活性七肽，主要作用于G-蛋白偶聯(lián)的Mas受體發(fā)揮作用，在體內(nèi)主要發(fā)揮拮抗AngⅡ的作用。許多研究顯示足細(xì)胞的直接損傷參與了子癇前期蛋白尿的產(chǎn)生，提示子癇前期腎臟損傷是足細(xì)胞病。我們前期研究顯示與正常

2、妊娠孕婦相比，子癇前期患者血清及尿液中Ang-(1-7)水平降低，且其水平與足細(xì)胞損傷及蛋白尿的發(fā)生密切相關(guān)，表明循環(huán)及腎臟局部降低的Ang-(1-7)是子癇前期腎臟損傷的原因之一。在本研究中我們借助體外足細(xì)胞培養(yǎng)，誘導(dǎo)子癇前期體外足細(xì)胞損傷模型，進(jìn)一步探討Ang-(1-7)在子癇前期腎小球足細(xì)胞損傷中的作用。
　　方法:
　　應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)條件性永生的人腎臟足細(xì)胞，收集子癇前期患者血清及正常妊娠孕婦血清刺激足細(xì)

3、胞，并于子癇前期患者血清中加入不同濃度Ang-(1-7)與足細(xì)胞共孵育，應(yīng)用CCK8試劑盒檢測(cè)足細(xì)胞活性，Western blot檢測(cè)足細(xì)胞Mas受體的表達(dá)，以及足細(xì)胞標(biāo)志蛋白(nephrin、podocin、WT-1)的表達(dá)，免疫熒光觀察足細(xì)胞骨架蛋白F-actin的變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)足細(xì)胞的凋亡。加入Mas受體拮抗劑A779后，觀察上述變化。
　　結(jié)果:
　　1.足細(xì)胞活性檢測(cè):與FBS孵育足細(xì)胞相比，正常妊娠孕婦及子

4、癇前期患者血清干預(yù)足細(xì)胞均可使其活性降低，但都高于90％;在FBS中加入不同濃度 Ang-(1-7)(10-5，10-6，10-7M)及A779(10-5，10-6，10-7M)，足細(xì)胞活性沒有明顯變化。
　　2.Mas受體的表達(dá):免疫印跡結(jié)果顯示人足細(xì)胞株表達(dá)Mas受體。
　　3.足細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)的變化:與正常妊娠組比較，子癇前期組足細(xì)胞nephrin、WT-1蛋白表達(dá)降低(nephrin:0.42±0.04-fold

5、VS0.64±0.07-fold of GAPDH，P＜0.005; WT-1:0.28±0.05-fold VS0.46±0.09-fold of GAPDH, P＜0.05),podocin蛋白表達(dá)未有變化。
　　4.不同濃度Ang-(1-7)對(duì)子癇前期足細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響:在子癇前期患者血清中加入不同濃度的Ang-(1-7)，Ang-(1-7)在10-6M濃度對(duì)足細(xì)胞有最大保護(hù)作用，nephrin、WT-1表達(dá)增加(ne

6、phrin:0.57±0.07-fold VS0.42±0.04-foldof GAPDH,P＜0.05; WT-1:0.41±0.04-fold VS0.28±0.05-fold ofGAPDH,P＜0.05)。Mas受體拮抗劑A779可拮抗Ang-(1-7)對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用，與PE+Ang-(1-7)相比，加入A779后，nephrin、WT-1表達(dá)減少（nephrin:1.55±0.20-fold VS2.1±0.19-fold

7、 of GAPDH,P＜0.01;WT-1:0.60±0.08-fold VS0.84±0.13-fold of GAPDH,P＜0.01)。
　　5.足細(xì)胞標(biāo)志蛋白在基因水平的表達(dá)變化:與正常妊娠組相比，子癇前期組足細(xì)胞nephrin、WT-1在mRNA水平表達(dá)降低(nephrin:23.28±3.94 VS7.16±0.65,P＜0.005; WT-1:2.01±0.0.42 VS1.03±2.23, P＜0.05)。加入An

8、g-(1-7)后，nephrin與WT-1 mRNA表達(dá)增加(nephrin:12.78±3.89，P＜0.005; WT-1:2.23±0.29，P＜0.05)，A779可拮抗上述作用。
　　6.Ang-(1-7)對(duì)足細(xì)胞骨架蛋白F-actin的影響:與正常妊娠組比較，子癇前期組足細(xì)胞骨架蛋白F-actin表達(dá)減少，排列紊亂，子癇前期患者血清中加入Ang-(1-7)可緩解子癇前期患者血清引起的足細(xì)胞骨架重排。A779可拮抗Ang

9、-(1-7)的作用。
　　7.Ang-(1-7)對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響:與正常妊娠組(2.36±1.05％)比較，子癇前期組足細(xì)胞凋亡增加(8.55±0.68％，P＜0.001)。子癇前期患者血清中加入Ang-(1-7)后，足細(xì)胞凋亡明顯減少（4.47±0.73％）。A779可拮抗Ang-(1-7)的作用。
　　結(jié)論:
　　Ang-(1-7)可緩解子癇前期患者血清引起的足細(xì)胞損傷。
　　第二部分 MAPK通路在Ang

10、-(1-7)對(duì)子癇前期足細(xì)胞影響中的機(jī)制作用
　　目的:
　　絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，能夠?qū)⒓?xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)（如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等）。研究證實(shí)，在大鼠腎小管近端細(xì)胞中，Ang-(1-7)可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的ERK1/2，p38 MAPK與JNK的

11、磷酸化。在腎臟內(nèi)皮細(xì)胞中，Ang-(1-7)可抑制高糖誘導(dǎo)的蛋白合成及p38 MAPK的磷酸化。盡管已有研究證實(shí)足細(xì)胞可表達(dá)ACE2并且在體外培養(yǎng)中可以合成Ang-(1-7)，但Ang-(1-7)對(duì)足細(xì)胞信號(hào)通路的作用還未明確。因此本研究目的是探討MAPK通路是否參與Ang-(1-7)對(duì)子癇前期足細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　方法:
　　應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，收集正常妊娠孕婦及子癇前期患者血清干預(yù)人足細(xì)胞，設(shè)立正常妊娠組，子癇前期組

12、，子癇前期+ Ang-(1-7)、子癇前期+Ang-(1-7)+A779，正常妊娠組+A779進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用Western blot檢測(cè)MAPK組分ERK1/2、p38、JNK磷酸化的變化。
　　結(jié)果:
　　1.MAPK通路變化:與正常妊娠組相比，子癇前期組p38、ERK1/2、JNK磷酸化增加(p-p38:1.69±0.20-fold VS1.08±0.16-fold of GAPDH, P＜0.005;pERK:1.92

13、±0.35-fold VS1.04±0.26-fold of GAPDH, P＜0.005;pJNK:2.35±0.35-fold VS1,79±0.30-fold of GAPDH，P＜0.05)。子癇前期患者血清中加入Ang-(1-7)后，可以降低子癇前期患者血清誘導(dǎo)的p38、ERK1/2、JNK磷酸化增加(p-p38:1.23±0.18-fold VS1.69±0.20-fold of GAPDH，P＜0.05: pERK:1.1

14、4±0.25-fold VS0.87±0.18-fold of GAPDH,P＜0.01;pJNK:1.90±0.10-fold VS2.35±0.35-fold of GAPDH，P＜0.05)，A779可以拮抗這一作用。
　　2.各組細(xì)胞上清中AngⅡ濃度變化:與正常妊娠組相比，子癇前期組細(xì)胞上清中AngⅡ濃度降低(NP:97.10±6.18 VS PE:73.80±0.25，P＜0.05)，PE組加入Ang-(1-7)后，可