子癇前期腎損傷標(biāo)志物及AnG-(1-7)對(duì)其足細(xì)胞損傷保護(hù)作用的研究.pdf

1、第一部分子癇前期腎損傷的臨床研究
　?。ㄒ唬┳影B前期相關(guān)危險(xiǎn)因素研究
　　目的:
　　通過(guò)對(duì)臨床病例收集整理及生化指標(biāo)的檢測(cè)，研究子癇前期患者危險(xiǎn)因素及其與子癇前期發(fā)病率的相關(guān)性。探討不同危險(xiǎn)因素對(duì)子癇前期患者以及圍生兒不良妊娠結(jié)局的影響。
　　方法:
　　收集2011年5月-2012年3月在復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院住院分娩的正常妊娠孕婦、妊娠期高血壓孕婦及子癇前期患者各25例。檢測(cè)產(chǎn)前產(chǎn)后血壓、腎功

2、能、肝功能、血尿常規(guī)、尿白蛋白、尿肌酐、血脂、超敏C反應(yīng)蛋白、免疫指標(biāo)、凝血功能等指標(biāo)。觀察子癇前期發(fā)生的可能機(jī)制及獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　結(jié)果:
　　1、與正常妊娠組比較，子癇前期組年齡，分娩孕周，體重，BMI均有明顯差異，剖宮產(chǎn)、水腫及經(jīng)產(chǎn)婦比例均較正常妊娠組高;分娩后5min、分娩后2h的收縮壓及舒張壓升高;血尿素氮、肌酐、尿酸、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶升高;以MDRD公式計(jì)算eGFR的結(jié)果及CKD-EPI公式計(jì)算的eGFR的結(jié)果、總

3、蛋白、白蛋白、球蛋白、A/G下降;IgG、C4（P＜0.05），與正常妊娠組及妊娠期高血壓組比較，子癇前期24小時(shí)尿蛋白定量、尿微量白蛋白、尿ACR升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。與妊娠期高血壓組比較，子癇前期組分娩孕周、總蛋白、白蛋白，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。血壓、腎功能，血脂、凝血功能、免疫指標(biāo)均有變化，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、研究發(fā)現(xiàn)子癇前期組較正常妊娠組早產(chǎn)兒、低體重兒比例高，其中體重、身長(zhǎng)差別具

4、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，Apgar評(píng)分較正常妊娠組下降，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、通過(guò)二分類多因素logistic回歸分析顯示孕婦年齡≤20歲或≥33歲、高血壓家族史、水腫、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶、白蛋白水平降低、是子癇前期發(fā)生的危險(xiǎn)因素是子癇前期發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　結(jié)論:
　　腎功能中肌酐、尿素氮、尿酸、尿白蛋白、尿ACR及年齡、BMI、高血壓家族史、水腫、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶、白蛋白、IgG、C4的變化與子癇前期的

5、發(fā)生有關(guān)系。子癇前期患者胎早產(chǎn)及低出生體重的概率明顯增加，母嬰不良結(jié)局的發(fā)生率明顯增加。年齡過(guò)大或過(guò)小、高血壓家族史、水腫、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶升高、低白蛋白血癥是子癇前期發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　?。ǘ┳影B前期腎損傷標(biāo)志物的研究
　　目的:
　　通過(guò)檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)分析正常孕婦、妊娠期高血壓患者及子癇前期患者的血清和尿液相關(guān)指標(biāo)、腎功能水平及腎損傷標(biāo)志物水平，尋找子癇前期腎損傷的敏感因子，以期早期發(fā)現(xiàn)腎損傷，早期治療。
　　

6、方法:
　　選自從2011年5月-2012年3月在復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院住院分娩的正常孕婦、妊娠期高血壓孕婦及子癇前期患者各25例。分別檢測(cè)產(chǎn)前和產(chǎn)后血壓、腎功能及腎損傷標(biāo)志物(血清Cystatin C、RBP、NGAL、IL-18，尿KIM-1、RBP、NGAL、IL-18)水平。
　　結(jié)果:
　　1、與正常妊娠組比較，子癇前期患者的尿RBP、血Cystatin C、血NGAL、尿NGAL、尿IL-18、尿K

7、IM-1水平顯著升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、與正常妊娠組比較，研究發(fā)現(xiàn)子癇前期患者的血RBP、血IL-18下降，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　3、血RBP、尿RBP、尿NGAL與血肌酐成顯著正相關(guān)，血IL-18與血肌酐、尿ACR成顯著負(fù)相關(guān)，血Cystatin C、尿IL-18、血尿NGAL與尿ACR成顯著正相關(guān)(P＜0.05)，但相關(guān)關(guān)系均不密切(r＜0.5)。
　　4、尿RBP、尿

8、KIM-1與尿ACR成顯著正相關(guān)(P＜0.01)，且相關(guān)關(guān)系密切。血CystatinC、尿KIM-1、血NGAL、尿IL-18與血肌酐成顯著正相關(guān)(P＜0.05)，且相關(guān)關(guān)系密切(r＞0.5)。
　　5、血RBP與血肌酐、尿ACR無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)。
　　6、腎損傷標(biāo)志物血Cystatin C、尿RBP、尿NGAL、尿KIM-1的最佳截?cái)嘀捣謩e為Cystatin C＜0.935 mg/l，尿RBP＜0.600 mg

9、/l，尿NGAL＜39.889 ng/ml，尿KIM-1＜1.6432 ng/ml。靈敏度和特異度分別為80％/64％，80％/78％，70％/90％，80％/80％。
　　7、腎損傷標(biāo)志物血CystatinC、尿RBP、尿NGAL、尿KIM-1兩兩聯(lián)合，靈敏度和特異度分別為:96％/49.92％(血Cystatin C與尿RBP聯(lián)合);94％/57.60％(血Cystatin C與尿NGAL聯(lián)合);96％/51.20％(血Cys

10、tatin C與尿KIM-1聯(lián)合);94％/70.20％(尿RBP與尿NGAL聯(lián)合)，96％/62.40％(尿RBP與尿KIM-1聯(lián)合)，94％/72％(尿NGAL與尿KIM-1聯(lián)合)。三個(gè)指標(biāo)聯(lián)合，血Cystatin C+尿RBP+尿KIM-1聯(lián)合，靈敏度92％，特異度為88％;血Cystatin C+尿NGAL+尿KIM-1聯(lián)合，靈敏度94％，特異度為80％;血Cystatin C+尿RBP+尿NGAL聯(lián)合，靈敏度90％，特異度為7

11、2％;尿RBP+尿NGAL+尿KIM-1聯(lián)合，靈敏度94％，特異度為94％;血Cystatin C+尿NGAL+尿RBP+尿KIM-1，靈敏度100％，特異度為98.20％。
　　結(jié)論:
　　1、子癇前期腎損傷標(biāo)志物血Cystatin C、血NGAL、尿RBP、尿NGAL、尿IL-18、尿KIM-1顯著升高。子癇前期患者血Cystatin C、尿KIM-1、血NGAL、尿IL-18與血肌酐關(guān)系密切，尿RBP與尿ACR關(guān)系密切

12、。
　　2、子癇前期腎損傷標(biāo)志物血Cystatin C、尿RBP、尿KIM-1的靈敏度最高，KIM-1的特異度最高。子癇前期腎損傷標(biāo)志物兩個(gè)指標(biāo)聯(lián)合時(shí)，尿NGAL與尿KIM-1靈敏度及特異度最高;三個(gè)指標(biāo)聯(lián)合時(shí)，尿RBP+尿NGAL+尿KIM-1靈敏度和特異度為最高;血Cystatin C+尿NGAL+尿RBP+尿KIM-1聯(lián)合診斷子癇前期的靈敏度100％，特異度為98.20％。
　　第二部分子癇前期腎損傷的實(shí)驗(yàn)研究

13、　　目的:
　　觀察在子癇前期疾病形成過(guò)程中，足細(xì)胞凋亡是否參與腎臟損傷，探討足細(xì)胞損傷的可能機(jī)制，為子癇前期的發(fā)生尋找新的作用機(jī)制，為臨床防治子癇前期探索新的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　通過(guò)體外培養(yǎng)條件永生化小鼠足細(xì)胞株，用正常孕婦、妊娠期高血壓患者及子癇前期患者血清干預(yù)足細(xì)胞24h，收集細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，行臺(tái)盼藍(lán)、CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性、Annexin-Ⅴ檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，行Real-time PCR檢測(cè)

14、足細(xì)胞podocin及Mas受體mRNA表達(dá)情況，行Western-Blot檢測(cè)足細(xì)胞標(biāo)志蛋白podocin、WT1及Mas受體蛋白含量的變化情況。
　　結(jié)果:
　　1、足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變:
　　足細(xì)胞經(jīng)不同血清刺激干預(yù)后，Leica倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)子癇前期組刺激的足細(xì)胞體積減小，排列紊亂，胞體萎縮，足突減少縮短，二級(jí)結(jié)構(gòu)消失，部分細(xì)胞脫落。
　　2、臺(tái)盼藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞活性:
　　不同患者血清干預(yù)足細(xì)胞后，

15、經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，研究顯示，子癇前期血清干預(yù)組與正常足細(xì)胞組、正常孕婦血清干預(yù)組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。與妊娠期高血壓孕婦血清干預(yù)組比較，細(xì)胞活性下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3、CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性:
　　通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。子癇前期血清干預(yù)組與正常足細(xì)胞組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），子癇前期與正常孕婦及妊娠期高血壓干預(yù)組比較，差別無(wú)

16、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡:
　　利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。流式細(xì)胞儀分析顯示子癇前期患者足細(xì)胞凋亡比例最高，與正常足細(xì)胞組、正常妊娠組及妊娠期高血壓血清干預(yù)組比較，子癇前期血清干預(yù)組細(xì)胞凋亡比例明顯增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。熒光顯微鏡下觀察子癇前期孕婦血清干預(yù)的足細(xì)胞凋亡數(shù)目最多。
　　5、Realtime及Western Blot結(jié)果

17、:
　　通過(guò)Realtime及Western Blot檢測(cè)相關(guān)mRNA及蛋白質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期血清干預(yù)組與正常未干預(yù)組比較，podocin mRNA表達(dá)下降(P＜0.05)，MasmRNA表達(dá)下降(P＜0.01)，子癇前期組與正常孕婦血清干預(yù)組比較，podocin mRNA表達(dá)無(wú)差異，Mas mRNA表達(dá)下降（P＜0.01），子癇前期組與妊娠期高血壓組比較，podocin及Mas mRNA的表達(dá)均無(wú)明顯差異。子癇前期組與正常未干

18、預(yù)組及正常孕婦血清干預(yù)組比較， WT1蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，與正常未干預(yù)組及正常孕婦血清干預(yù)組比較，子癇前期組podocin、Mas蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，與妊娠期高血壓組比較，子癇前期組Mas、podocin、WT1蛋白表達(dá)均下降，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　足細(xì)胞損傷參與到子癇前期的發(fā)病過(guò)程中，子癇前期患者血清干預(yù)足細(xì)胞可以引起足細(xì)胞的凋亡增

19、加。子癇前期患者血清可使足細(xì)胞podocin、Mas mRNA及podocin、WT1及Mas蛋白表達(dá)含量下降。足細(xì)胞存在Mas受體，子癇前期患者血清干預(yù)可使Mas表達(dá)含量下降，Mas含量的下降可能在子癇前期患者腎臟損傷中起重要作用。
　　第三部分Ang-(1-7)對(duì)子癇前期腎損傷的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:
　　研究不同濃度Ang-(1-7)水平對(duì)子癇前期腎臟足細(xì)胞的保護(hù)性作用，以期為臨床治療子癇前期腎損傷探索新

20、的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　足細(xì)胞分化成熟后，以不同濃度Ang-(1-7)(10-5、10-6、10-7mol/L)加入子癇前期患者血清培養(yǎng)的足細(xì)胞中，干預(yù)培養(yǎng)24h后觀察細(xì)胞形態(tài)并收集細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)、CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性、Annexin-Ⅴ檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，Realtime及Western檢測(cè)相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、臺(tái)盼藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞活性:
　　各組足細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后，與子癇前期

21、血清干預(yù)組比較，子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-6干預(yù)組差別活力細(xì)胞活性升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-5干預(yù)組及子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-7干預(yù)組與子癇前期孕婦血清干預(yù)組相比，細(xì)胞活性升高，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性:
　　通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，與子癇前期血清干預(yù)組比較，子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1

22、-7)10-5干預(yù)組及子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-6干預(yù)組與子癇前期血清干預(yù)組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-7干預(yù)組與子癇前期孕婦血清干預(yù)組相比，細(xì)胞活性升高，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、Annexin-Ⅴ/PI檢測(cè)細(xì)胞活性:
　　利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。研究顯示，子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-5干預(yù)組及子癇前期孕婦血

23、清刺激+Ang-(1-7)10-6干預(yù)組與子癇前期血清干預(yù)組相比細(xì)胞活性升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-7干預(yù)組與子癇前期孕婦血清干預(yù)組相比，細(xì)胞活性升高，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。熒光顯微鏡下觀察:子癇前期孕婦血清干預(yù)的足細(xì)胞凋亡數(shù)目最多，子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-5干預(yù)組有早期凋亡細(xì)胞;子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-7干預(yù)組早期凋亡及晚期凋亡細(xì)胞數(shù)目

24、較子癇前期少，但比子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-5干預(yù)組及子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-6干預(yù)組凋亡細(xì)胞數(shù)目多。
　　4、Real time檢測(cè)mRNA表達(dá)情況
　　研究發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-6較子癇前期組podocin、MasmRNA及podocin、WT1、Mas蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），子癇前期孕婦血清刺激+Ang-(1-7)10-5