碘131標記抗血管緊張素Ⅱ1型受體單克隆抗體對肝細胞癌早期診斷價值的實驗研究.pdf

1、研究目的
　　肝細胞癌是最常見的惡性腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第六位、死亡率的第三位。盡管組織活檢被認為是診斷肝細胞癌的金標準，但是相對于血清生物標志物檢測和影像學(xué)診斷技術(shù)，組織活檢更具侵入性和創(chuàng)傷性。目前肝細胞癌的早期診斷主要依賴于血清甲胎蛋白檢測和肝臟影像學(xué)診斷技術(shù)如B超、CT、磁共振和PET-CT。但是臨床資料顯示，當探查到異常時，肝細胞癌往往已進入中晚期，患者已出現(xiàn)臨床癥狀。因此目前臨床上迫切需要一種非侵入性的監(jiān)測

2、技術(shù)早期診斷肝細胞癌。
　　分子影像整合了分子生物學(xué)、免疫學(xué)、核醫(yī)學(xué)和影像診斷學(xué)技術(shù)，可以非侵入性、實時監(jiān)測疾病發(fā)生發(fā)展，是目前最理想的非侵入性分子診斷技術(shù)。該技術(shù)成功實施主要依賴于特異性靶分子的發(fā)現(xiàn)和鑒定。盡管多項研究報道了分子影像診斷的靶分子的特征，但是迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)用于肝癌的早期診斷高效特異的靶分子。因此，尋找一種能早期特異性檢測腫瘤的靶向分子用于肝細胞癌分子影像學(xué)診斷已經(jīng)成為目前研究的熱點，也是臨床肝癌早期診斷的迫切需要

3、。
　　最近報道血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)在許多類型腫瘤中高表達。AT1R通過升高血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，促進腫瘤生長和血管生成。但是該分子是否在肝癌中表達尚不清楚。我們提出以下科學(xué)假說:肝細胞癌組織中AT1R表達顯著升高，131I-anti-AT1RmAb可能是一種潛在的新型肝癌分子顯像劑，有望用于肝癌的早期診斷。
　　研究方法
　　細胞培養(yǎng)
　　選擇小鼠肝細胞癌細胞系H22、小鼠肝細胞系NCTCc

4、lone1469、人宮頸癌細胞系Hela和大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系PC12，用RPMI1640培養(yǎng)基（含100u/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和10％胎牛血清）、5％CO2，37℃恒溫培養(yǎng)，常規(guī)傳代。
　　動物模型
　　6～8周齡的雄性BALB/c小鼠購自山東大學(xué)實驗動物中心，在無病原體條件下飼養(yǎng)。通過右上背部注射1×107/0.1mL的H22細胞懸液建立小鼠肝細胞癌移植瘤模型。
　　anti-AT1RmAb和

5、同型IgG的碘化標記
　　選取50μganti-AT1RmAb或同型IgG，分別用15μLNa131I(185MBq)，通過Iodogen法碘化標記，SephadexG-25凝膠柱分離標記物。
　　放化學(xué)純度和穩(wěn)定性
　　利用紙層析法測定放化學(xué)純度。分別將2μL131I-anti-AT1RmAb或131I-IgG加到400μL血清或鹽水中。取2μL混合液加到距層析紙下緣2cm，自然揮發(fā)干燥后，分別用丙酮或乙醇∶水∶氫氧

6、化氨(2∶5∶1)展開。充分展開后，取出層析紙晾干，切成1cm寬的條帶，置于試管底部，用井型伽瑪計數(shù)儀測量。放射化學(xué)純度(％)=131I-anti-AT1RmAb或131I-IgG的放射性活性/總的放射性活性×100。在第1、6、24、48、72和96小時分別測量放化學(xué)純度以評價標記物穩(wěn)定性。
　　放射性配體結(jié)合試驗
　　放射性配體結(jié)合試驗在高硼硅玻璃試管中進行。飽和實驗反應(yīng)混合液包括200μL的H22細胞(5×106/mL

7、)和100μL梯度濃度(0.1～32nM)的131I-anti-AT1RmAb，用1×PBS補齊到500μL體積。10-1～105nM未標記的anti-AT1RmAb和12nM131I-anti-AT1RmAb用于競爭結(jié)合實驗?；旌弦?7℃下孵育2小時，用細胞收集器分離結(jié)合的放射性配基，用WipeTest/WellCounter測量結(jié)合的放射性配基的放射性活性。將飽和實驗和競爭結(jié)合實驗的結(jié)果進行非線性回歸分析，計算平衡解離常數(shù)(KD)、

8、最大結(jié)合量(Bmax)、抑制常數(shù)(Ki)和半數(shù)抑制濃度(IC50)。
　　全身放射自顯影
　　實驗前3天飲水中加入10％KI封閉小鼠甲狀腺。注射H22細胞12天荷瘤鼠建立后，小鼠尾靜脈注射3.7MBq131I-anti-AT1RmAb或131I-IgG。分別于注射后的1、6、24、48和72小時行全身放射自顯影。將小鼠麻醉后仰臥位四肢伸展固定在磷屏上，確保腫瘤緊貼磷屏。磷屏曝光15分鐘后用CyclonePlusStorage

9、PhosphorSystem掃描并用OptiQuantAcquisition軟件分析。
　　131I-anti-AT1RmAb和131I-IgG的生物學(xué)分布
　　分別于注射后1、6、24、48和72小時，每組處死6只小鼠，取血液、腫瘤、對側(cè)肌肉組織和主要器官，稱重，γ計數(shù)儀測量放射性活性，計算％ID/g和T/NT比值。
　　藥代動力學(xué)分析
　　分別于0、1、3、6、12、24、48、72、96和120小時于眶周靜

10、脈取血10μL，用伽瑪計數(shù)儀測量放射性活性，計算分布半衰期(T1/2α)、消除半衰期(T1/2β)和平均停留時間(MRT)。
　　實時定量PCR
　　AT1R的引物序列為:有義鏈，5'-GAAGAACAAGCCAAGAAATGATG-3';反義鏈，5'-TTGATGACTCCAGGTTAGCAGAT-3'(887bp)。Trizol一步法提取細胞或組織RNA，合成cDNA，聚合酶鏈反應(yīng)。擴增條件:94℃變性4分鐘;94℃擴增

11、30個循環(huán)，每個循環(huán)30秒;55℃1分鐘;72℃1秒。利用2-△△CT法定量分析靶基因表達水平。
　　組織學(xué)分析
　　標本用4％多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片。切片脫蠟，常規(guī)HE染色，檢測組織形態(tài)學(xué)變化;用anti-AT1RmAb免疫組化染色檢測AT1R的表達。Image-ProPlusv5.0.2軟件定量分析AT1R蛋白的表達水平。
　　Westernblot
　　提取的H22腫瘤組織蛋白經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝

12、膠電泳后轉(zhuǎn)膜、封閉，anti-AT1RmAb(1∶400)孵育過夜，HRP標記的二抗孵育2小時，ECL化學(xué)發(fā)光液發(fā)光。β-actin(1∶1000)作為內(nèi)參，HeLa細胞和PC12細胞作為陽性對照。
　　統(tǒng)計學(xué)分析
　　利用SPSSv11.5進行統(tǒng)計學(xué)分析。連續(xù)型變量資料用平均數(shù)±標準誤表示，用one-wayANOVA、非配對或配對t檢驗分析。P＜0.05認為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　研究結(jié)果
　　anti-AT1Rm

13、Ab和同型IgG的碘化標記
　　131I-anti-AT1RmAb和131I-IgG的放化學(xué)純度分別為92.8％和93.2％，比活度分別為35.24±5.76MBq/μmol和38.61±7.18MBq/μmol。
　　131I-AT1RmAb對AT1R的親和力
　　放射性配體結(jié)合實驗是定量檢測標記抗體對目標受體親和力的最敏感的技術(shù)。本研究獲得的KD和Bmax分別為1.83±0.48nM和5361±345.3cpm，K

14、i和IC50分別為9.68±1.33nM和73.13±1.33nM。結(jié)果表明131I-AT1RmAb對AT1R有高親和力。
　　131I-AT1RmAb和131I-IgG的穩(wěn)定性
　　標記物放置72小時后131I-anti-AT1RmAb和131I-IgG的放化學(xué)純度在血清中仍高于90％，在生理鹽水中下降到了80％以下，表明它們在血清中比在生理鹽水中更穩(wěn)定。同一環(huán)境下兩種顯像劑之間無明顯差異。
　　荷肝細胞癌小鼠的全身

15、放射性自顯影
　　注射碘化標記的anti-AT1RmAb或同型IgG24小時后全身放射性自顯影圖像顯示，與131I-IgG組相比，131I-anti-AT1RmAb組的肝細胞癌顯像更清楚，這種差異在48小時達到最大。結(jié)果表明，131I-anti-AT1RmAb比131I-IgG更特異地靶向肝細胞癌。
　　131I-anti-AT1RmAb和131I-IgG的體內(nèi)生物學(xué)分布
　　131I-anti-AT1RmAb組腫瘤組

16、織的％ID/g明顯高于其他組織，T/NT比值在注射48小時后達到高峰。131I-IgG組腫瘤組織的％ID/g無顯著增加，整個實驗過程中T/NT比值保持低水平。這些結(jié)果表明，肝癌組織比其他組織攝取更多的131I-anti-AT1RmAb，而肝癌組織不選擇性地攝取131I-IgG。因此，131I-anti-AT1RmAb可能是潛在的新型肝癌靶向顯像劑。
　　藥代動力學(xué)分析
　　藥代動力學(xué)分析表明，131I-anti-AT1RmA

17、b的藥代動力學(xué)符合二室模型，包括快速分布期和緩慢清除期。T1/2α和T1/2β分別為5.7小時和156.7小時，MRT為8.8小時。
　　AT1RmRNA和蛋白的表達
　　H22細胞的AT1RmRNA水平明顯高于正常肝細胞。與之一致的是，肝細胞癌組織的AT1RmRNA水平也明顯高于對側(cè)肌肉和正常肝組織。AT1R蛋白主要定位于細胞膜。H22細胞的AT1R蛋白水平明顯高于正常肝細胞。與之一致，肝細胞癌組織的AT1R蛋白水平明顯高