IL-23和Th17細胞在多發(fā)性硬化發(fā)病中作用的研究.pdf

1、多發(fā)性硬化是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的炎癥性脫髓鞘性疾病，多發(fā)生于年輕患者，具有反復發(fā)作、病情進行性加重，預后差等特點。很多患者由于炎癥反復發(fā)作，病情難以控制而導致不同程度的神經(jīng)功能喪失，給社會和家庭帶來嚴重的危害。 MS的病因和發(fā)病機制尚未完全明確，在EAE中起核心作用的是IL—23誘導產(chǎn)生的以分泌IL-17、IL-17F、TNF、IL—6等促炎癥細胞因子為特征的Th17細胞。正是這群Th17細胞亞群具有高度的致病性，并對EAE的誘導

2、和維持起關鍵的作用。 IL—23是最近發(fā)現(xiàn)的一種促炎癥細胞因子，在促進Th17細胞的生成和功能的發(fā)揮中起著關鍵性的作用。IL—23是IL-12家族新成員，是由其特有的p19亞基和與IL-12共有的p40亞基構成的異源性二聚體。同樣，IL—23的受體也由一條是和IL-12R共同的IL-12Rβ1以及另一條特有的受體鏈IL—23R所組成。IL—23透過與其受體相結合，促進Th17細胞的分化和增殖，并促進Th17細胞分泌特征性炎癥因

3、子IL-17，從而構成IL—23-IL23R—Th17-IL-17通路，在自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)腱中起著重要作用。在炎癥性腸病、銀屬病以及類風濕性關節(jié)炎等多種自身免疫性疾病的組織和體液中均檢測到IL—23和IL-17的高表達。在MS患者的腦組織內也發(fā)現(xiàn)IL—23和IL-17表達上調。 本實驗對IL—23-IL23R—Th17-IL-17通路在MS發(fā)病機制中的作用進行了研究。以期揭示IL—23和Th17細胞在MS發(fā)病中的地位和作

4、用。并進一步探討了糖皮質激素治療MS對Th17細胞和IL-17的影響。最后我們還對中國人群中IL—23及其受體基因單核苷酸多態(tài)性與MS的關系進行了研究。 第一部分IL-23和Th17細胞在多發(fā)性硬化發(fā)病中作用的研究 目的： 研究IL—23/Th17細胞通路在多發(fā)性硬化發(fā)病中的作用。 方法： 1.以急性復發(fā)期MS患者(24人)、緩解期MS患者(7人)和正常人(15人)為研究對象。 2.采集外

5、周靜脈血，用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，調整細胞濃度為2×106細胞/ml，分兩部分于RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 3.一部分分離的PBMC加或不加CD3和CD28抗體共同刺激24小時。收集細胞上清，采用ELISA方法檢測血清和細胞培養(yǎng)上清中IL—23和IL-17的水平。 4.提取PBMC中總RNA，用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄為cDNA。設計IL—23p19、IL-17和內參照GAPDH特異性引物。分別應用

6、實時定量RT—PCR急性復發(fā)期MS患者、緩解期MS患者和正常人PBMC中IL—23p19 mRNA和IL-17mRNA的表達。 5.另一部分分離的PBMC，加PMA和ionomycin刺激半小時后加brefeldin A封閉以抑制細胞因子的分泌再作用4小時。然后加FITC標記的抗CD3流式抗體和APC標記的抗CD4抗體進行細胞表面染色，固定細胞，破膜，最后加PE標記的抗IL-17抗體或相應的同型對照抗體。上流式細胞儀檢測Th17

7、細胞亞群。 結果： 1.MS患者和正常人血清中IL—23和IL-17的水平。 結果表明急性復發(fā)期MS患者血清中IL—23水平顯著高于緩解期患者和正常人。急性復發(fā)期MS患者血清中IL-17的水平也高于緩解期患者和正常人，但未達到統(tǒng)計學意義。 2.MS患者和正常人PBMC中IL—23和IL-17的水平。 結果顯示，IL—23和IL-17在未刺激的PBMC中水平也較低或檢測不到；一旦經(jīng)抗CD3和CD28

8、抗體刺激后，IL-17水平在MS患者和正常人PBMC中均增高。并且，復發(fā)期急性階段患者刺激后的PBMC上清中IL—23和IL-17水平顯著高于緩解期患者和正常人。 3.MS患者和正常人IL—23p19和IL-17mRNA表達 未刺激的PBMC中IL—23p19和lL-17mRNA表達較低。刺激后IL—23p19和IL-17mRNA表達明顯升高。并且急性復發(fā)期MS患者PBMC中IL—23 p19mRNA表達顯著高于正常人。

9、同樣，急性復發(fā)期MS患者IL-17 mRNA表達也顯著高于靜止期MS患者和正常人 4.MS患者和正常人PBMC中Th17細胞的比例 未刺激的T細胞極少分泌IL-17，外周血循環(huán)中Th17細胞數(shù)量較少；一旦經(jīng)PMA和Ionomycin刺激后，Th17細胞數(shù)量顯著增加，并且在急性復發(fā)期患者Th17細胞明顯地高于緩解期患者和正常人。 結論： 急性復發(fā)期MS患者PBMC中IL—23p19 mRNA的表達增高，急性

10、復發(fā)期患者血清和PBMC培養(yǎng)上清中IL—23的水平也高于緩解期患者和正常人：同時，急性復發(fā)期MS患者血清IL-17的水平增高，刺激后PBMC中IL-17mRNA表達和IL-17產(chǎn)物也明顯增加；急性復發(fā)期MS患者外周血循環(huán)中Th17細胞比例增多，這些結果說明MS患者中IL—23-Th17細胞—IL-17通路可能在MS的發(fā)病機制中發(fā)揮作用。 第二部分甲基強的松龍對MS患者Th17細胞抑制作用的研究 目的： 研究MS發(fā)

11、病過程中甲基強的松龍對Th17細胞的影響，探討甲基強的松龍在MS治療中的作用機制。 方法： 1.抽取22例未處于急性復發(fā)期MS患者的外周靜脈血。這些MS患者接受甲基強的松龍連續(xù)治療5天后再次采集外周血。 2.分離用藥前后MS患者外周靜脈血的PBMC，加CD3和CD28抗體共同刺激24小時后收集上清和細胞。 3.采用ELISA方法檢測血清和培養(yǎng)的PBMC細胞上清中IL-17水平。 4.提取細胞總RN

12、A，逆轉錄成cDNA，實時定量RT—PCR檢測IL-17、IL23R和RORγt的mRNA表達。 5.MS患者用藥前后和正常人PBMC中加入PMA和ionomycin刺激4小時，最后4小時加BFA封閉以抑制細胞因子的分泌，固定細胞，然后破膜，加FITC標記的抗CD3流式抗體、APC標記的抗CD4抗體和PE標記的抗IL-17抗體或相應的同型對照抗體孵育。上流式檢測Th17細胞。 結果： 1.MS患者經(jīng)甲基強的松龍治

13、療后，臨床癥狀得到明顯的控制，神經(jīng)功能有不同程度的恢復，EDSS評分明顯降低。 2.MS患者甲基強的松龍治療后PBMC培養(yǎng)上清中IL-17的水平較用藥前顯著降低。 3.MS患者甲基強的松龍治療后PBMC中Th17細胞的比例顯著降低。 4.MS患者甲基強的松龍治療后IL-17mRNA的表達顯著降低，并且IL23R和Th17細胞的關鍵性轉錄因子RORγt mRNA表達也顯著降低。 結論： 我們的研究證

14、實，急性復發(fā)期MS患者經(jīng)甲基強的松龍治療后PBMC培養(yǎng)上清中IL-17的水平也顯著降低；P8MC中的Th17細胞比例也顯著下調。并且PBMC中IL23R和RORγt的mRNA表達也明顯被抑制。這些結果說明甲基強的松龍治療可以有效的抑制Th17細胞及其分泌的IL-17從而控制MS患者的細胞炎癥反應，并且可能通過阻斷IL23R和RORγt的表達來實現(xiàn)對Th17細胞的抑制作用。 第三部分IL-23及其受體基因多態(tài)性與多發(fā)性硬化相關性的

15、研究 目的： 探討IL—23亞單位及IL—23受體亞單位基因單核苷酸多態(tài)性與MS遺傳易患性的相關性，從遺傳學角度探討MS發(fā)生的危險因素。 研究對象和方法： 1.以臨床確診的150例MS患者和157例正常人為研究對象，采集外周靜脈血，提取基因組DNA； 2.采用PCR—RFLP法檢測IL12B基因單核苷酸多態(tài)性位點rs3212227和IL—23R基因單核苷酸多態(tài)性位點rs10889677，rs220

16、1841和rs7517847的基因型。計算基因型和等位基因頻率，進行統(tǒng)計分析； 3.進一步對IL—23R基因3個多態(tài)性位點之間進行連鎖不平衡和單倍體型分析。 結果： 1.CMS患者IL-12B基因rs3212227位點A等位基因頻率高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。攜帶A等位基因增加MS發(fā)病的危險性。 2.IL23R基因3個單核苷酸多態(tài)性位點的基因型和等位基因頻率同對照組比較，差異均未達到統(tǒng)計學意義。

17、 3.IL23R基因單核苷酸多態(tài)性rs10889677和rs2201841位點之間存在連鎖不平衡狀態(tài)。 4.rs10889677位點T等位基因、rs2201841位點C等位基因和rs7517847位點T等位基因構成的單倍體TCT在MS患者和CMS患者中分布頻率均顯著低于對照組。 5.CCT和TAT單倍體在CMS患者中分布頻率均顯著高于對照組。 結論： 1、IL—23亞單位基因單核苷酸多態(tài)性rs321