Lymphopenia Setting對腫瘤疫苗免疫效果的影響及機制研究.pdf

1、本研究以化療肺癌患者以及化療小鼠動物模型為切入點,通過觀察化療后體內淋巴細胞數量、不同免疫細胞亞群的比例變化,驗證是否存在“淋巴細胞減少及后續(xù)細胞活化增殖(lymphopenia setting)”現象；在此基礎上,以腫瘤疫苗免疫,通過體內免疫保護和體外功能檢測實驗,觀察在淋巴細胞減少狀態(tài)下是否能誘生免疫正應答以及對免疫效果的影響；更進一步,對其可能作用機制進行探討,并對其潛在的臨床應用前景提供理論基礎。
　　 1.肺癌化療患者

2、和化療小鼠存在lymphopenia setting現象
　　 淋巴細胞減少癥(lymphopenia)是指機體外周淋巴細胞絕對總數的減少,具體表現在:成人淋巴細胞總數<1000/μl,兒童(2歲以下)<3000/μl。淋巴細胞減少可以由遺傳和非遺傳因素導致,后者為臨床常見,如淋巴細胞減少癥在感染性疾病主要是以CD4+T細胞減少的艾滋病為代表；在腫瘤則多見于放、化療后引起的淋巴細胞減少。淋巴細胞減少后,機體為了維持自身免疫穩(wěn)定,

3、發(fā)生免疫自穩(wěn)性增生,初始T細胞活躍地分裂增殖,最后達到淋巴細胞減少前的正常水平,這個過程稱為“淋巴細胞減少驅動的細胞增殖”(Lymphopenia-dnven proliferation,LDP),我們將淋巴細胞數目從減少到回復的整個時期定義為“l(fā)ymphopenia setting”。為了觀察肺癌患者化療后是否存在lymphopenia setting及相應的免疫學特性變化,我們對23人次的肺癌患者化療后外周血免疫細胞數量及各淋巴細胞

4、亞群比例進行了檢測。結果表明,肺癌患者化療后的白細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數量均呈現先下降后回復的過程,歷時10天左右,其中在第4-6天,淋巴細胞數量下降至最低點,均小于1000/μl,表明化療患者存在lymphopenia setting現象。同時,我們以流式細胞術對CD8+、CD4+、CD4+CD25-以及CD4+CD25+T細胞亞群比例進行檢測。結果發(fā)現:隨著淋巴細胞數日發(fā)生改變,CD8+T細胞的比例檢測顯示沒有明顯變化,而CD4

5、+T細胞的比例隨之發(fā)生改變,表現為先降低后回復的過程,與淋巴細胞數量的改變相一致；進一步,CD4+T細胞中的CD4+CD25-T細胞比例沒有發(fā)生明顯變化,而CD4+CD25+T細胞比例呈現降低后回復的趨勢,提示在CD4+T細胞的比例改變中,主要是以CD4+CD25+T細胞的比例改變?yōu)橹?。綜合上述結果:腫瘤化療患者經歷了淋巴細胞數鼉減少,且CD4+T和CD4+CD25+T淋巴細胞亞群比例在lymphopenia setting狀態(tài)下發(fā)生顯

6、著性改變。
　　 為模擬臨床,我們用化療藥物在C57BL/6小鼠體內建立了淋巴細胞減少癥動物模型。參照臨床使用劑量,通過體表面積換算,以150mg/kg單次腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX),結果顯示:注射后第1天,外周血、脾臟和淋巴結中的淋巴細胞數顯著下降,第4天下降至最低谷,僅為正常數量的10％左右,隨后淋巴細胞數量緩慢上升,至第7-10天恢復至正常水平,呈現典型的lymphopeniasetting現象。FACS分析各淋巴細胞亞群

7、的比例也與臨床結果一致,即CD4+T和CD4+CD25+T細胞亞群比例隨著淋巴細胞數量的改變而發(fā)生相應的變化,而CD4+CD25-和CD8+T細胞亞群比例則基本保持不變。為說明這些結果并不是環(huán)磷酰胺特定藥物的特定作用,我們以另一臨床常見的肺癌化療藥物-泰素帝(Taxotere)40mg/kg單次處理C57BL/6小鼠,獲得了與環(huán)磷酰胺處理相同的結果。表明:1)化療藥物處理后呈現的lymphopenia setting并非某一特定藥物的特

8、定作用,是化療藥物作用后的普遍現象；2)成功地建立了能反映臨床化療后淋巴細胞減少癥的化療小鼠動物模型,為開展后續(xù)的lyrnphopenia setting狀態(tài)下的免疫應答研究奠定基礎。
　　 2、Lymphopenia setting對腫瘤疫苗誘導抗腫瘤免疫的影響
　　 Lymphopenia setting現象反映出機體具有淋巴細胞自穩(wěn)性增生的潛能,為證實這種潛能是否對外界抗原刺激產生特異性免疫應答,我們以小鼠Lewi

9、s肺癌細胞株3LL的CTL表位MUT-1荷載于DC表面制成腫瘤疫苗,在化療小鼠淋巴細胞數量減少的最低點(第4天)主動免疫,于免疫后7天用3LL腫瘤細胞攻擊,從體內、體外觀察小鼠腫瘤生長及生存、免疫應答的特異性增殖、殺傷及細胞因子分泌等功能。結果顯示,化療小鼠經腫瘤疫苗免疫后,誘生了有效的免疫應答,致敏淋巴細胞不僅對MUT-1特異性抗原肽的體外刺激具有增殖反應,而且對母本3LL細胞的刺激亦具有顯著的增殖效應；反應上清中細胞因子IFNγ的分

10、泌水平和體外特異性殺傷功能也呈現相同結果,提示腫瘤疫苗免疫化療小鼠能誘生有效的免疫正應答。更令人興奮的結果是,與未經歷lymphopeniasetting的正常小鼠腫瘤疫苗免疫效果相比較,化療小鼠誘生了增強的淋巴細胞特異性增殖、殺傷和細胞因子分泌功能(P<0.05),顯著抑制了腫瘤的體內生長(P<0.05),所有化療小鼠經歷主動免疫后對腫瘤細胞的攻擊具有抵抗作用,未見腫瘤生長,并長期存活(P<0.05)。為排除該保護性效應可能由于化療藥

11、物的直接作用引起,我們設立了單純使用化療藥物的對照組,結果發(fā)現體內、外均未能誘生免疫應答及保護效應；其次,為排除化療藥物對腫瘤疫苗的間接修飾作用,以化療藥物作用后第4天(淋巴細胞數量減少的最低點)的小鼠血清體外與DC-MUT1腫瘤疫苗孵育,隨后主動免疫正常小鼠,觀察腫瘤生長,結果發(fā)現:與未進行血清處理的DC-MUT1腫瘤疫苗結果相似,血清處理腫瘤疫苗不具有完全保護效應。提示DC-MUT1腫瘤疫苗在化療小鼠體內誘生的免疫應答以及增強的免疫

12、效果主要與淋巴細胞減少及后續(xù)的免疫細胞在外來抗原刺激下的活躍增殖相關。
　　 進一步,為更好地模擬臨床腫瘤患者化療誘生lymphopenia setting的免疫功能改變,我們首先以3LL腫瘤細胞接種C57BL/小鼠,造成荷瘤狀態(tài),再按常規(guī)給予化療藥物泰素帝(Taxotere),隨后給予3LL-GM(3LL轉染GM-CSF)腫瘤疫苗,體內觀察其生存情況,體外檢測小鼠的免疫功能。結果發(fā)現:荷瘤小鼠在化療誘生的lymphopenia

13、 setting下應用腫瘤疫苗免疫,獲得了明顯優(yōu)于未經歷lymphopenia setting小鼠的免疫應答,70％的荷瘤小鼠在化療和腫瘤疫苗的作用下成功地使腫瘤消退,其余30％荷瘤小鼠的腫瘤生長速度明顯減緩,而僅應用腫瘤疫苗或化療的小鼠均不能使荷瘤小鼠的腫瘤消退以及延長小鼠的生存時間,二者相比較具有顯著性差異(P<0.05)。進一步,對存活小鼠以3LL母本腫痛細胞再攻擊,所有小鼠均無腫瘤發(fā)生,提示存活小鼠獲得了特異性免疫記憶功能。體外

14、通過檢測細胞內細胞因子IFNγ的表達同樣證實3LL-GM腫瘤疫苗在化療小鼠體內誘生了特異性的細胞免疫應答。說明荷瘤小鼠在淋巴細胞減少狀態(tài)下進行腫瘤疫苗的主動免疫可以獲得有效的抗腫瘤免疫應答,最終使腫瘤消退,并維持小鼠長期存活。
　　 3、Lymphopenia setting增強抗腫瘤效應的可能機制研究
　　 在這部分研究內容中,我們對lymphopenia setting誘生增強的腫瘤免疫應答機制進行了探討,我們發(fā)現,

15、調節(jié)性T細胞在其中發(fā)揮關鍵的作用。首先,通過比較未進行化療的32例腫瘤患者與23例化療腫瘤患者外周血中的調節(jié)性T細胞比例,我們發(fā)現,未進行化療的臨床手術病人外周血及腫瘤浸潤淋巴細胞中CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞的比例顯著高于正常對照(P<0.05),表明腫瘤患者的Treg比例是升高的。而腫瘤化療患者,化療后的CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞的比例呈現顯著下降,但是,CD4+CD25+T、CD8+T細胞亞群的比例不

16、變,說明lymphopenia setting可以選擇性地下調Treg亞群比例,從而減少對CD8+T細胞效應功能發(fā)揮的抑制。其次,在動物模型中,根據化療后小鼠體內Treg的動態(tài)變化,我們分別在化療后第1、4、7天給予腫瘤疫苗免疫,隨后進行腫瘤細胞攻擊。結果顯示:在調節(jié)性T細胞亞群比例最低點(第4天)給予腫瘤疫苗,誘導出最佳的免疫應答,所有小鼠均獲得完全的保護效應,并長期存活:而在Treg亞群比例較高的第1和7天給予腫瘤疫苗,沒有獲得免疫

17、保護效應,提示Treg亞群比例的升高與未誘導出有效的免疫保護效應之間存在相關性,表明Treg參與了淋巴細胞減少癥下的免疫負調控。最后,在荷瘤小鼠的lymphopenia setting狀態(tài)下進行腫瘤疫苗免疫的實驗中,我們以抗CD8+T細胞亞群的單克隆抗體注射化療小鼠,清除體內的CD8+T細胞亞群,結果發(fā)現所有小鼠的腫瘤呈進行性快速生長,提示CD8+T細胞亞群介導的細胞免疫應答在抗腫瘤免疫應答中的重要性。然而,當我們以抗CD4+T細胞亞群