重癥肝炎相關(guān)基因hfg12表達(dá)質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及其體外RNA干擾的初步研究.pdf

1、纖維介素蛋白(fgl2)在重型病毒性肝炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮較為重要的作用，本課題旨在探索人纖維介素蛋白(hfgl2)的發(fā)夾狀雙鏈RNA(shRNA)在體外對(duì)hfgl2基因表達(dá)的干擾作用規(guī)律，為重型病毒性肝炎的基因治療提供新的思路。 方法 構(gòu)建hfgl2真核表達(dá)載體pcDNA3.1-hfgl2、hfgl2-EGFP融合基因表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-hfgl2和hfgl2shRNA的表達(dá)質(zhì)粒p-hfgl2shRNA1和p-hfgl2s

2、hRNA2。將pEGFP-hfgl2和hfgl2shRNA的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞，作為試驗(yàn)組，另將僅轉(zhuǎn)染pEGFP-hfgl2或共轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列shRNA表達(dá)質(zhì)粒和pEGFP-hfgl2作為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染24、48h后，熒光顯微鏡下觀察hfgl2-EGFP融合蛋白在CHO細(xì)胞中的表達(dá)情況，以判斷融合蛋白表達(dá)受到干預(yù)的情況。 結(jié)果 1.通過(guò)PCR、酶切和核苷酸測(cè)序表明：成功地構(gòu)建了hfgl2真核表達(dá)載體pcDNA3.1-

3、hfgl2，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，細(xì)胞爬片免疫組織化學(xué)染色可見胞漿中存在明顯的陽(yáng)性棕染。 2.通過(guò)PCR、酶切和核苷酸測(cè)序表明：成功地構(gòu)建了hfgl2-EGFP融合基因表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-hfgl2，該質(zhì)粒在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中可以表達(dá)hfgl2-EGFP融合蛋白，可通過(guò)熒光顯微鏡觀察到綠色熒光。 3.通過(guò)PCR、酶切和核苷酸測(cè)序表明：成功地構(gòu)建了hfgl2shRNA表達(dá)質(zhì)粒p-hfgl2shRNA1和p-hf

4、gl2shRNA2，構(gòu)建的質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)可以產(chǎn)生發(fā)夾狀雙鏈RNA,雙鏈部分長(zhǎng)19bp，序列與hfgl2mRNA的一段基因序列一致。 4.本研究所設(shè)計(jì)并構(gòu)建的hfgl2shRNA表達(dá)質(zhì)粒能特異有效地抑制CHO細(xì)胞內(nèi)hfgl2-EGFP融合蛋白的表達(dá)。 結(jié)論 本研究hfgl2靶點(diǎn)序列的選擇是成功的，基于靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)并構(gòu)建的hfgl2shRNA表達(dá)質(zhì)粒p-hfgl2shRNA1和p-hfgl2shRNA2可在體外實(shí)驗(yàn)中有