各種表達(dá)dsRNA的質(zhì)粒誘導(dǎo)昆蟲(chóng)細(xì)胞RNA干擾作用的比較.pdf

1、RNA干擾是一種廣泛存在于線蟲(chóng)、果蠅、斑馬魚(yú)、真菌和植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。自從1998年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已有大量的研究表明，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA能在同源雙鏈RNA(dsRNA)存在時(shí)完全降解，達(dá)到幾乎與基因剔除相同的效果。因RNA干擾方法簡(jiǎn)便靈活，越來(lái)越多的被用于功能基因組學(xué)的研究。同時(shí)，RNA干擾在基因治療領(lǐng)域也得到廣泛關(guān)注。 桿狀病毒是一類在自然界中僅感染節(jié)肢動(dòng)物的病毒，屬桿狀病毒科。其基因組為環(huán)狀雙鏈DNA分子，大小在8

2、8-160kb。桿狀病毒模式種苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)于1994年完成測(cè)序，含有154個(gè)可能的開(kāi)放閱讀框，目前已經(jīng)鑒定的基因約只有70個(gè)。 在桿狀病毒及昆蟲(chóng)細(xì)胞中，同樣存在RNA干擾現(xiàn)象。已有研究表明，體外轉(zhuǎn)錄合成的dsRNA注入昆蟲(chóng)細(xì)胞，能夠抑制侵染細(xì)胞的桿狀病毒基因表達(dá)。將特異性針對(duì)gp64或者iel基因的dsRNA導(dǎo)入昆蟲(chóng)細(xì)胞甚至蟲(chóng)體，能夠阻斷桿狀病毒的復(fù)制，并且使昆蟲(chóng)存活時(shí)間延長(zhǎng)。 本研究設(shè)計(jì)構(gòu)

3、建了多種能表達(dá)dsRNA的載體，包括兩個(gè)啟動(dòng)子構(gòu)成雙向結(jié)構(gòu)、單個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)長(zhǎng)的反向重復(fù)序列和短發(fā)卡結(jié)構(gòu)等。利用gfp基因作為報(bào)道基因，通過(guò)檢測(cè)昆蟲(chóng)細(xì)胞中該基因的表達(dá)量來(lái)觀察干擾效果。 用表達(dá)gfp的p402質(zhì)粒與所構(gòu)建的載體共轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)sr21細(xì)胞的結(jié)果表明：果蠅Hsp70啟動(dòng)子表達(dá)長(zhǎng)反向重復(fù)序列且?guī)в蠥cMNPV增強(qiáng)子hr5的pT-hr5-HP-Dgfp抑制效果最好，兩個(gè)AcMNPV極早期基因iel啟動(dòng)子構(gòu)成的雙向結(jié)構(gòu)質(zhì)粒p40

4、2-Dielp-egfp也能很好的抑制gfp表達(dá)，而兩個(gè)Hsp70啟動(dòng)子構(gòu)成的雙向結(jié)構(gòu)質(zhì)粒pBS-DHP-egfp效果最差，短發(fā)卡結(jié)構(gòu)質(zhì)粒和兩個(gè)不同啟動(dòng)子構(gòu)成的雙向結(jié)構(gòu)質(zhì)粒的效果介于其間。 在利用RNAi干擾病毒基因表達(dá)方面，以各種表達(dá)dsRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞12—24小時(shí)后，利用兩種分別用多角體蛋白啟動(dòng)子(AcVL-GFP)和Hsp70啟動(dòng)子(B9F)表達(dá)gfp基因的重組桿狀病毒感染細(xì)胞，結(jié)果表明，這些載體對(duì)AcVL-G

5、FP中g(shù)fp表達(dá)影響不大；但在B9F中，p402-Dielp-gfp能明顯抑制GFP的表達(dá)，pT-IH(hr5)一gfp效果次之，而pT-hr5-HP-Dgfp效果不顯著。 利用Hsp70啟動(dòng)子和iel啟動(dòng)子，選擇gp64基因中的兩段分別構(gòu)建了iel啟動(dòng)子和Hsp70雙啟動(dòng)子反向結(jié)構(gòu)質(zhì)粒pT-IH(hr5)-gp64．1和pT-IH(hr5)．gp64和正反義鏈獨(dú)立的p402一sgp64和p402-asgp64、雙iel啟動(dòng)子反