人KCNJ15基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其體外功能研究.pdf

1、研究背景及目的:重型肝炎病情兇險(xiǎn)，死亡率極高，發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜。本研究室前期利用基因芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，較乙型慢性輕度肝炎（CHB）患者，KCNJ15基因在乙型重型肝炎（SHB）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）表達(dá)顯著上調(diào)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，KCNJ15在乙型重型肝炎（SHB）患者外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞表達(dá)顯著上調(diào)，尤其以CD4+T細(xì)胞更為顯著。本研究的目的在于構(gòu)建人KCNJ15真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)體外轉(zhuǎn)染人急性T淋巴細(xì)胞白血

2、病T淋巴細(xì)胞(Jurkat細(xì)胞)，探討Jurkat細(xì)胞的功能變化，以探討KCNJ15在乙型重型肝炎（SHB）發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的免疫致病作用。
　　 研究方法:收集乙型重型肝炎患者外周血，分離PBMC后提取RNA，以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板,通過(guò)設(shè)計(jì)的KCNJ15特異性引物擴(kuò)增其全長(zhǎng)開放閱讀框序列（ORF），利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建KCNJ15真核表達(dá)質(zhì)粒，測(cè)序明確序列正確性。利用電轉(zhuǎn)染的方法將KCNJ15真核表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入Jurkat細(xì)

3、胞，分別利用Real-time PCR和Western blot法檢測(cè)基因和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Jurkat細(xì)胞表面活化分子CD25、CD69的表達(dá)及細(xì)胞因子的分泌情況。
　　 研究結(jié)果:成功的構(gòu)建了人KCNJ15真核表達(dá)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染KCNJ15真核表達(dá)質(zhì)粒后，Jurkat細(xì)胞表面活化標(biāo)志未見明顯改變，Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-17A的表達(dá)上調(diào)、IL-9的表達(dá)下調(diào)。
　　 研究結(jié)論:成